通过调节JAK2-STAT3和Wnt5a信号通路可能是缺血后处理及低温减轻全脑缺血性脑损伤的分子机制

摘要

目前国内外已经有大量的试验证实低温对全脑缺血的脑保护作用。低温的脑保护作用不仅局限在减少能量代谢和氧耗，还具有抑制兴奋性氨基酸释放、抑制氧自由基的过度形成和细胞内钙离子(Ca2+)超载，明显增加脑组织对缺血的耐受性。临床心脏外科手术体外循环中已经成功地将不同程度的低温应用于术中脑保护，特别是深低温停循环技术应用于部分婴幼儿主动脉弓部手术。
　　研究证实JAK蛋白和JAKs蛋白通路广泛参与细胞的增殖、分化、应激、凋亡以及炎症反应和免疫调节等过程。关于JAK-STAT途径的研究大多集中在肿瘤、肝脏疾病、神经细胞的生成、造血系统疾病和心脏病中研究较多。
　　Wnt基因编码的Wnt蛋白家族属于分泌型糖蛋白，它们通过旁分泌或自分泌作用与位于细胞膜上的受体相结合，激活胞内的各级信号传导分子，调节靶基因的表达。Wnt/Ca2+通路主要由wnt5a和 wntll激活，可能通过 G蛋白激活PLC(Phospholipase C)和PKC(ProteinkinaseC)，从而引起细胞内Ca2+浓度增加和Ca2+敏感信号成分的激活。近年来，该通路其在炎症及凋亡中的作用逐渐引起人们的关注。
　　基于以上的理论及研究结果，考虑到婴幼儿主动脉弓部手术，存在低温、全脑缺血的过程，我们设计了该课题，以期探讨JAK2-STAT3通路和Wnt5a非经典信号通路是否参与低温和缺血后处理介导脑保护的分子机制，进一步指导临床应用。本课题分为以下几个部分：
　　第一部分 探讨减轻全脑缺血性脑损伤的最佳缺血后处理方案
　　目的：探讨减轻全脑缺血性脑损伤的最佳缺血后处理方案
　　方法：以成年雄性SD大鼠为研究对象，以四血管阻塞法，夹闭双侧颈总动脉20分钟，建立大鼠全脑缺血模型为基本方法。开放双侧颈总动脉再灌注前分别采取多种短暂性脑缺血后处理方案，后处理方案包括7组：缺血再灌注组、15秒×1次（15×1）组、15秒×3次（15×3）组、30秒×1次（30×1）组、30秒×3次（30×3）组、60秒×1次（60×1）组，空白组，每组8只SD大鼠。48h后，检测大鼠神经功能损伤评分后，处死，行前脑切片HE染色和TUNEL染色，Western blot法检测脑组织bcl-2、caspase-3的表达量，观察不同缺血后处理方案对全脑缺血后再灌注脑组织的损伤情况。
　　结果：缺血再灌注组大鼠脑额顶叶皮质及相应的皮质下结构可见明显神经元损伤，而且损伤程度最严重。与缺血再灌注组比较，五种缺血后处理方案均能减轻大全脑缺血再灌注所致的脑损伤，但减轻程度不一样，其中，缺血后处理15x3组效果最明显。
　　结论：实验结果显示，短暂性脑缺血后处理对大鼠全脑脑缺血具有神经保护作用。其中，缺血后处理15秒x3次方案可能是本实验设计方案中的最佳方案。
　　第二部分 缺血后处理及低温通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤。
　　目的：（1）研究JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道在大鼠全脑脑缺血后的不同时间的表达。
　　（2）研究JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道在缺血后处理及深低温条件下减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤中的作用。
　　方法：（1）以成年雄性SD大鼠为研究对象，建立大鼠常温下全脑缺血模型，每组6只SD大鼠，设立空白对照组，在脑缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各设一组，检测大鼠神经功能损伤评分，免疫组织化学法和western blot法分别检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Wnt5a，β-catenin的表达。
　　（2）另外再设计7组实验，每组6只SD大鼠，分为缺血再灌注对照组、缺血后处理组、低温组、缺血后处理+低温组、缺血后处理+低温+AG490组、缺血后处理+低温+特异性Ca2+抑制剂组、缺血后处理+低温+AG490+特异性Ca2+抑制剂组，全脑脑缺血经处理后恢复灌注24h后检测大鼠神经功能损伤评分，同时通过western blot法检测脑组织JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Wnt5a、的表达的蛋白表达水平。
　　结果：大鼠全脑脑缺血再灌注后，p-JAK2、p-STAT3、Wnt5a在大脑皮质的表达24h达到高峰，JAK2、STAT3缺血24h表达最少，β-catenin表达变化不明显。缺血后处理及低温均可减轻全脑脑缺血再灌注脑损伤，两个作用可以相互叠加，两种保护措施被AG490或特异性Ca2+抑制剂或二者混合物抑制。
　　结论：JAK2-STAT3和 Wnt5a非经典信号通道在全脑脑缺血再灌注后早期被激活，24小时达到高峰。此外，缺血后处理及低温可能通过调节JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道减轻大鼠全脑脑缺血性再灌注脑损伤。
　　第三部分 通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道抑制炎症反应可能是缺血后处理及低温减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤的机制之一。
　　目的：（1）探讨大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤后炎症反应以及炎症介质不同时间的表达水平。
　　（2）进一步探讨是否通过JAK-STAT和Wnt5a非经典信号通道抑制炎症反应，从而减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤。
　　方法：（1）以成年雄性SD大鼠为研究对象，建立大鼠常温下全脑缺血模型，每组6只SD大鼠，设立空白对照组，在脑缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各设一组，分别检测髓过氧物酶(MPO)的表达含量，以免疫组织化学法和western blot法进一步检测缺血脑组织促炎症因子TLR2、TLR4、NF-κB和COX-2的表达水平，用ELISA法检测大鼠血清TNF-α的含量。
　　（2）另外再设计8组实验，每组6只SD大鼠，分为缺血再灌注对照组、空白对照组、缺血后处理组、低温组、缺血后处理+低温组、缺血后处理+低温+AG490组、缺血后处理+低温+特异性Ca2+抑制剂组、缺血后处理+低温组+AG490+特异性Ca2+抑制剂组，全脑脑缺血经处理后恢复灌注24h后，分别检测各组检测髓过氧物酶(MPO)的表达含量，大脑组织TNF-α的分泌情况，通过western blot法检测脑组织促炎症因子COX-2、NF-κB的表达水平。
　　结果：炎症标志物MPO含量从脑缺血后24h达到高峰，维持至48h，到72小时逐渐下降，但仍高于正常水平。TLR2、TLR4、COX-2、NF-κB和 TNF-α的表达也于脑缺血后24h达到高峰。缺血后处理及低温可降低全脑脑缺血再灌注脑损伤后的炎症反应以及促炎症因子的表达水平，两个作用可以相互叠加，两种保护措施被AG490或特异性Ca2+抑制剂或二者混合物抑制。
　　结论：大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤诱导炎症反应和促炎症因子的表达，24小时达到高峰。此外，缺血后处理及低温通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道抑制炎症介质的表达和炎症反应，这可能是减轻大鼠全脑脑缺血性再灌注脑损伤的机制之一。
　　第四部分 通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道抑制神经元凋亡可能是缺血后处理及低温减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤的机制之一。
　　目的：（1）探讨大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤后不同时间点神经元凋亡的水平。
　　（2）进一步探讨是否通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道抑制神经元凋亡，从而减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤。
　　方法：（1）以成年雄性SD大鼠为研究对象，建立大鼠常温下全脑缺血模型，每组6只SD大鼠，设立空白对照组，在脑缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各设一组，以Tunel染色法和western blot法进一步检测缺血脑组织bcl-2/BAX，caspase-3的表达水平。
　　（2）另外再设计8组实验，每组6只SD大鼠，分为缺血再灌注对照组、空白对照组、缺血后处理组、低温组、缺血后处理+低温组、缺血后处理+低温+AG490组、缺血后处理+低温+特异性Ca2+抑制剂组、缺血后处理+低温组+AG490+特异性Ca2+抑制剂组，全脑脑缺血经处理后恢复灌注24h后，通过大脑HE染色及Tunel染色了解脑细胞凋亡情况，western blot法进一步检测缺血脑组织bcl-2/BAX，caspase-3的表达水平。
　　结果：全脑脑缺血再灌注脑损伤后缺血脑组织发生神经元凋亡，凋亡从脑缺血后开始，24h达到高峰，高峰期维持到48-72h，随后降低，但仍高于正常水平。缺血后处理及低温可降低全脑脑缺血再灌注脑损伤后的BAX、caspase-3的表达水平，升高bcl-2的表达水平，两个作用可以相互叠加，两种保护措施被AG490或特异性Ca2+抑制剂或二者混合物抑制。
　　结论：大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤诱导缺血脑组织神经元凋亡，BAX、caspase-3的表达水平的激活。此外，缺血后处理及低温通过JAK2-STAT3和Wnt5a非经典信号通道抑制BAX、caspase-3的激活及脑细胞的凋亡，这可能是减轻大鼠全脑脑缺血性再灌注脑损伤的机制之一。

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中文摘要

英文摘要

第一部分探讨多种全脑缺血后处理方案减轻全脑缺血性脑损伤的最佳方案

材料和方法

实验结果

讨论

参 考 文 献

第二部分探讨缺血后处理及低温通过JAK-STAT和Wnt5a非经典信号通道减轻大鼠全脑缺血再灌注脑损伤

材料和方法

实验结果

讨论

参 考 文 献

第三部分通过JAK-STAT和Wnt5a非经典信号通道抑制炎症反应可能是缺血后处理及低温减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤的机制之一。

材料和方法

实验结果

讨论

参 考 文 献

第四部分通过JAK-STAT和Wnt5a非经典信号通道抑制神经元凋亡可能是缺血后处理及低温减轻大鼠全脑脑缺血再灌注脑损伤的机制之一

材料和方法

实验结果

讨论

参 考 文 献

Wnt5a信号通路与炎症及凋亡的关系

参 考 文 献

致谢

研究生期间（2006-2012年）发表的文章