重组腺病毒介导NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞生物学行为的影响

摘要

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一种多功能的蛋白。c-Met为HGF的受体，是一种原癌基因的蛋白产物。它是一种具有生长因子受体结构和功能性质的跨膜酪氨酸激酶。一旦结合至其配体，该受体发生自我磷酸化可刺激其内在的酪氨酸激酶活性，从而引起细胞的迁移、增殖和侵袭等行为的改变。已在多种人类的肿瘤中发现c-Met基因的过表达。HGF/c-Met通路已被证实影响着许多恶性肿瘤的发生和发展。在骨髓瘤病人的血清和骨髓中发现HGF浓度明显高于正常人，并且发现这跟病人的预后呈明显的负相关。之前有研究显示，c-Met及其配体HGF在多株骨髓瘤细胞系和原代骨髓瘤细胞中高表达。此外，有研究指出HGF可促进骨髓瘤细胞的增殖和迁移。
　　综上，推测阻断HGF/c-Met信号通路也许对多发性骨髓瘤的治疗具有重要的意义。NK4是一种HGF的拮抗剂，由N末端的发夹结构和4个kringle结构域组成。NK4一旦结合至c-MET上，可竞争性拮抗HGF所诱导的c-MET酪氨酸磷酸化作用，从而抑制HGF所介导的细胞增殖、迁移和侵袭。此外，NK4还具有抑制成纤维细胞生长因子（BFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）所诱导的血管生成作用。NK4除了HGF拮抗活性外的抗血管生成活性可能与其结构类似血管抑制生长因子的4个kringle结构域有关。NK4这种具有抑制肿瘤细胞和肿瘤血管生成的多重功能，暗示了其在多发性骨髓瘤患者治疗的潜在价值。在本课题，初步探讨了Ad-NK4对多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226生物学行为的影响及可能的机制，旨在为NK4在多发性骨髓瘤治疗中的潜在临床应用提供理论基础和实验依据。
　　本文从以下几个方面进行论述：
　　第一部分：利用Gateway技术构建重组腺病毒pAd-NK4
　　研究目的:利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子（HGF）NK4基因的重组腺病毒载体。研究方法:以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因，将回收的NK4 PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。从该重组质粒上，利用LR同源重组将NK4-IRES-EGPF表达框转移至腺病毒骨架质粒 pAD/BL-DEST，获得重组腺病毒质粒pAd-NK4-IRES-EGFP。该质粒经pacI线性化后转染293包装细胞获得重组腺病毒rAd-NK4-IRES-EGFP。采用TCID50（Tissue cell infectious dosage50，TCID50）法测定重组腺病毒滴度。重组腺病毒分别经酶切和PCR等方法进行鉴定。荧光显微镜观察转染效果。研究结果:证实腺病毒载体中含有NK4基因的目的片段；病毒滴度为6.3×108 PFU/ml；荧光显微镜发现该重组腺病毒能在HEK293细胞中高效的表达。结论:利用Gateway技术可以快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色荧光的重组腺病毒，为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。
　　第二部分：Ad-NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖的影响
　　研究目的:观察Ad-NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖的影响及可能机制。研究方法:1.Western blot和RT-PCR检测在转染Ad-NK4的RPMI8226细胞中NK4的表达。2.MTT法体外观察Ad-NK4对RPMI8226细胞增殖抑制作用。3.PI单染流式细胞仪检测Ad-NK4对RPMI8226细胞凋亡发生率的影响。4.DNA琼脂糖凝胶电泳实验验证Ad-NK4对RPMI8226细胞的诱导凋亡作用。5.Western blot检测Akt/mTOR通路主要执行蛋白、细胞周期调控蛋白及细胞凋亡相关蛋白的表达。研究结果:1.Ad-NK4转染的RPMI8226细胞组中NK4基因的表达明显高于对照组。2.Ad-NK4转染的RPMI8226细胞组在24、48和72小时的增殖抑制率分别为33.5％±1.21%、52.8%±1.63%和54.8%±1.77%（p<0.05）。3.PI单染流式细胞仪检测结果显示Ad-NK4转染的RPMI8226细胞组的凋亡率为21.2%，明显高于对照组（3.52%）。4.DNA琼脂糖凝胶电泳实验显示Ad-NK4转染的RPMI8226细胞组的DNA有特征性“梯级”断裂。5.细胞周期调控蛋白CDK4和Cyclin D1被下调，而P27蛋白却被上调。抗凋亡蛋白Bcl-2被下调，而促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-9和 Cleaved caspase3的表达均增加。相应地，Bax/Bcl-2二者的比例在增加。Akt/mTOR信号通路下游主要执行蛋白如P-AKT, P-mTOR, P-70S6K和 P-4BEP-1等的表达量均被下调，但T-AKT的表达量未受到影响。结论：Ad-NK4可抑制人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的增殖，并且通过上调Bax/Bcl-2二者的比例和活化caspase而导致的细胞凋亡是其增殖抑制的重要因素。此外，Akt/mTOR信号通路可能参与了其凋亡过程。
　　第三部分：Ad-NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞粘附的影响
　　研究目的:观察Ad-NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞粘附的影响及可能机制。研究方法:1.细胞-基质粘附实验检测Ad-NK4对RPMI8226细胞粘附影响。2.RPMI8226细胞和ECV304细胞粘附实验检测Ad-NK4对RPMI8226细胞粘附的影响。3.Western blot检测粘附和侵袭相关蛋白MMP2\MMP3\MMP7\VEGF表达的变化。研究结果:1.RPMI8226细胞与基质Matrigel粘附实验显示：Ad-NK4组、UO126作用组、RAPA作用组及AG490作用组对粘附的抑制率分别为62.6%、47.8%、15.7%和50.5%，均明显高于Ad-GFP组（0.4%）（P<0.05）。另外，RPMI8226细胞与基质FN粘附实验显示：Ad-GFP组、Ad-NK4组、UO126作用组、RAPA作用组及AG490作用组对粘附的抑制率分别为0、46.2%、59.4%、7.7%和55.8%，其中Ad-NK4组、UO126作用组和AG490作用组对粘附的抑制率均明显高于未转染组（P<0.05）。而RAPA作用组、Ad-GFP组和未转染组之间对粘附的抑制率无明显差异（P>0.05）。2.RPMI8226细胞与ECV304粘附实验显示：Ad-NK4组、UO126作用组、RAPA作用组及AG490作用组对粘附的抑制率分别为61.9%、58.8%、20.7%和54.1%，均明显高于未转染组（P<0.05）。而Ad-GFP组和未转染组之间对粘附抑制率无明显差异（P>0.05）。3.与未转染组或Ad-GFP组相比较，Ad-NK4组能明显降低RPMI8226细胞MMP-2、MMP-3和VEGF蛋白的表达水平（P<0.05），但对MMP-7的蛋白表达水平无明显影响（P>0.05）。另外，Ad-GFP组和未转染组之间对MMP-2、MMP-3、MMP-7和VEGF蛋白的表达水平无明显差别（P>0.05）。结论：Ad-NK4可抑制人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的粘附作用，Erk信号通路和JAK/STAT信号通路可能涉及。
　　第四部分：Ad-NK4与硼替佐米联合对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡的作用
　　研究目的:探讨Ad-NK4与硼替佐米(BOR)联合应用对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡的影响及其相关机制。研究方法:1.采用MTT法检测Ad-NK4单用及与BOR联合应用对RPMI8226细胞增殖的抑制作用。2.采用PI流式细胞术检测各作用组RPMI8226细胞凋亡的影响。3.采用Western Blot技术检测各作用组RPMI8226细胞Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的变化。研究结果:1.RPMI8226细胞分别按Ad-GFP组、Ad-NK4组、BOR组、Ad-GFP+BOR联合组及Ad-NK4+BOR联合组进行处理，采用MTT法测量各组在24 h、48 h和72 h的细胞增殖情况。在24 h时，以上各组的细胞增殖抑制率分别为6.65%、37.4%、27.1%、21.2%和68.5%。在48 h时，以上各组的细胞增殖抑制率分别为0、52.6%、29.7%、34.6%和59.7%。在72 h时，以上各组的细胞增殖抑制率分别为4.9%、59.7%、50.7%、41.3%和74.1%。在不同时间点，Ad-NK4与BOR联合作用组对RPMI8226细胞增殖抑制率均明显高于BOR单独作用组。2. Ad-NK4和BOR联合作用组RPMI8226细胞凋亡率（47.5%），明显高于Ad-NK4（12.1%）或BOR（14.5%）单独作用组。3. Western blot结果显示：联合作用组RPMI8226细胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白水平均明显高于BOR或Ad-NK4单独作用组，而Bcl-2蛋白水平却相反，同时在联合作用组Bax/Bcl-2比率增加。结论：Ad-NK4可增强BOR对RPMI8226细胞增殖的抑制，增加RPMI8226细胞的凋亡，并且可能通过活化Caspase-3和上调Bax/Bcl-2比率的途径增强凋亡作用。

目录

封面

声明

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中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

材料与方法

结果

1 pBluescript II-SK(+)-HGF质粒的鉴定

2 PCR扩增NK4基因

3 pYr-adshuttle-6-NK4载体鉴定

4 重组腺病毒载体pAd-NK4的鉴定

5 重组腺病毒rAd-NK4的PCR鉴定

6 重组腺病毒的扩增及滴度测定

7 重组腺病毒rAd-NK4感染HKE293细胞

8 腺病毒介导的NK4在HEK293细胞中的表达

讨论

参考文献

第二部分Ad-NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖的影响

材料和方法

结果

1 NK4基因在RPMI8226细胞上的表达情况

2 NK4对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖抑制作用

3 流式细胞仪DNA的倍体分析

4 DNA断裂琼脂糖凝胶电泳分析

5 Ad-NK4对细胞周期相关蛋白表达的影响

6 Ad-NK4对细胞凋亡相关蛋白表达的影响

7 Ad-NK4对Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

讨论

参考文献

第三部分Ad-NK4对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞粘附的影响

材料和方法

结果

1 Ad-NK4对RPMI8226细胞与胞外基质（Matrigel 和FN）之间粘附的影响

2 Ad-NK4对RPMI8226细胞与ECV304细胞之间粘附的影响

3 Ad-NK4对肿瘤细胞粘附和侵袭相关蛋白的影响

讨论

参考文献

第四部分Ad-NK4与硼替佐米联合对人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡的作用

材料和方法

结果

1 Ad-NK4与Bortezomib协同增殖抑制作用

2 Ad-NK4与Bortezomib对RPMI8226细胞凋亡作用

3 Ad-NK4与Bortezomib对RPMI8226细胞凋亡蛋白的影响

讨论

参考文献

综述

参考文献

致谢

英文缩略语对照表

附图