棕榈酸对βTC6细胞PANDER表达的影响及Exendin-4的保护作用

摘要

目的：用不同浓度棕榈酸（PA）干预小鼠胰岛细胞瘤系βTC6细胞不同时长，并加用c-jun氨基末端激酶（JNK）特异性抑制剂SP600125，观察JNK信号转导通路关键蛋白JNK及其下游底物c-jun磷酸化情况，以及胰腺衍生因子（PANDER）的表达变化，探讨PA对β细胞PANDER表达的影响及JNK信号转导通路在其中的作用；建立小干扰RNA（siRNA）沉默PANDER表达，观察βTC6细胞PANDER沉默前后脂性凋亡的变化以及凋亡关键分子caspase-3的活性变化，探讨PA作用下PANDER上调对β细胞脂性凋亡的影响及可能机制；加用胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体长效激动剂Exendin-4处理细胞，观察Exendin-4对PA作用下βTC6细胞凋亡及PANDER表达的影响，以及在这一过程中JNK信号通路和caspase-3的活性变化，探讨Exendin-4拮抗β细胞脂性凋亡的可能机制，为临床新药开发提供一定的实验和理论依据。文章主要从以下几部分展开论述：
　　第一部分 棕榈酸对βTC6细胞PANDER表达的影响
　　方法：（1）分别以不同浓度PA（0，0.125，0.25，0.5或1.0mmol/L）干预βTC6细胞不同时长（0，6，12，24或48 h），用实时荧光RT-PCR法及Western blot法检测PANDER mRNA及蛋白的表达变化；（2）以0.5mmol/L的PA干预βTC6细胞0，0.1，0.25，0.5，1，6，12和24 h，应用Western blot法，使用能特异识别JNK、c-jun的磷酸化位点的抗体来检测JNK, c-jun的磷酸化水平，从而说明这两种蛋白的活化程度；（3）将βTC6细胞分为四组，分别为对照组、PA组（0.5mmol/L的PA干预24 h）、SP600125组（25umol/L SP600125处理细胞24 h）和PA+SP600125组（25umol/L SP600125预处理细胞1 h，再予25umol/L SP600125+0.5mmol/L PA处理细胞24h），应用Western blot法检测PANDER、p-JNK、JNK、c-jun、p-c-jun的变化。
　　结果：（1）PA可上调βTC6细胞PANDER表达，在mRNA水平，PA的作用高峰为0.5mmol/L，干预12 h；而在蛋白水平，PA的作用高峰出现在0.5mmol/L，干预24 h。（2）PA可致JNK通路活化，且有两个高峰，分别出现在PA干预6min及12h。（3）应用SP600125可有效抑制PA诱导的JNK及其下游c-jun磷酸化，且PA诱导的PANDER表达随之降低。
　　结论：PA通过活化JNK信号转导通路上调β细胞PANDER表达。
　　第二部分 PANDER在PA所致的βTC6细胞脂性凋亡中的作用
　　方法：（1）根据小鼠PANDER基因（GenBank Accession Number:52793）的序列，选择6个位点，于体外设计并合成 siRNA。评估转染效率后，以Lipofectamine2000作为载体进行瞬时转染。同时设置空白对照组（Blank Control， BC），阴性对照组（Negative Control，NC）以及转染试剂组暴露组（mock）。应用实时荧光PT-PCR及Western blot法检测各组PANDER mRNA及蛋白表达情况。（2）将βTC6细胞分NC组，siRNA组，NC+PA组及siRNA+PA组进行干预。PA的干预浓度和时间根据第一部分实验结果选择，为0.5 mmol/L，24h。用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）和Annexin V-FITC-PI双染，流式细胞术检测细胞凋亡。用Western blot法检测caspase-3蛋白水解后的两个亚单位，评估caspase3活化程度。
　　结果：（1）应用序列Fam3b-mus-208可抑制PANDER基因表达，与NC组相比，在mRNA水平，抑制率达78％，在蛋白水平，抑制率约为60%，可用于后续实验；（2）PA干预后，NC组细胞caspase-3活化，凋亡显著增加；转染PANDER siRNA的细胞caspase-3活化减少，细胞凋亡率有所降低。
　　结论：PA可能通过上调PANDER表达进而活化caspase-3诱导胰岛β细胞凋亡。
　　第三部分 Exendin-4对βTC6细胞脂性凋亡的保护作用
　　方法：（1）以浓度逐渐升高的Exendin-4（12.5，25，50或100nmol/L）预处理βTC6细胞24 h，再予相应浓度的Exendin-4联合0.5mmol/L PA共同干预βTC6细胞24h，用Western blot法检测细胞PANDER蛋白表达。（2）将βTC6细胞分对照组、Exendin-4组、PA组及Exendin-4+PA组进行干预。PA的干预浓度和时间根据第一部分实验结果选择，为0.5 mmol/L，24h。Exendin-4的干预浓度根据本部分第一小节实验结果选择，为50nmol/L，预孵育细胞24 h后再与0.5 mmol/L PA共同干预24 h。用TUNEL法和Annexin V-FITC-PI双染，流式细胞术检测细胞凋亡。用Western blot法检测细胞PANDER、p-JNK、JNK、c-jun、p-c-jun及cleaved caspase-3表达的变化。
　　结果：（1）Exendin-4浓度依赖性降低PA诱导的βTC6细胞PANDER表达。（2）0.5mmol/L PA处理βTC6细胞24h后，p-JNK、PANDER表达增多，caspase-3活化，细胞凋亡明显增多；加用Exendin-4可一定程度抑制PA诱导的JNK活化，进而下调PANDER表达，减少caspase-3活化，拮抗脂性凋亡。
　　结论：Exendin-4可能部分通过抑制JNK-PANDER-caspase-3通路，拮抗β细胞脂性凋亡。

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前言

参考文献：

第一部分：棕榈酸对βTC6细胞PANDER表达的影响

引言

材 料 与 方 法

1. 材 料

2. 方 法

结果

1. PA干预对βTC6细胞PANDER表达的影响

2. PA干预对βTC6细胞JNK及其下游c-jun活性的影响

3. JNK通路在PA诱导的βTC6细胞PANDER表达中的作用

讨论

小结

参考文献

第二部分：PANDER在PA所致的βTC6细胞脂性凋亡中的作用

引言

材 料 与 方 法

1. 材 料

2. 方 法

结果

1. siRNA抑制βTC6细胞PANDER的表达

2. PANDER在PA诱导的βTC6细胞凋亡中的作用

3. PANDER在PA诱导的caspase3活化中的作用

讨论

小结

参考文献

第三部分：Exendin-4对βTC6细胞脂性凋亡的保护作用

引言

材 料 与 方 法

1. 材 料

2. 方 法

结果

1. 不同浓度Exendin-4对PA诱导的PANDER表达的影响

2. Exendin-4对PA诱导的βTC6细胞凋亡的保护作用

3. Exendin-4对PA干预下βTC6细胞p-JNK, JNK, PANDER和cleaved caspase-3表达的影响

讨论

小结

参考文献

全 文 总 结

综述

参考文献：

附录

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