基底刚度对登革病毒2型感染人原代脐静脉内皮细胞影响的初步研究

摘要

目的:探讨细胞培养基底刚度对登革病毒感染人原代脐静脉内皮细胞（HUVEC）的影响。
　　方法:利用丙烯酰胺和双丙烯酰胺制备模拟正常人血管内皮细胞基底刚度的水凝胶（0±4Kpa），采用 MTS法检测细胞的增殖，流式细胞仪检测不同基底刚度上HUVEC的细胞周期和凋亡率。常规方法鉴定增殖登革II型病毒（DENV-2），利用DENV-2（MOI=10）感染人原代脐静脉内皮细胞，透射电镜观察接毒组和正常对照组细胞超微结构的变化，了解登革病毒是否可以引起HUVEC的改变，通过DAPI染色未发现明显的早期凋亡和晚期凋亡。再通过MTS法比较种植在塑料基底与水凝胶上的HUVEC经登革病毒感染后，细胞增殖率的变化，最后通过硝酸还原酶法检测两组细胞释放NO的水平以及双抗体夹心 ELISA法检测 ET-1的表达。
　　结果:
　　1.利用正常新生儿脐带可分离培养原代HUVEC，细胞贴壁呈梭形，排列整齐，呈鹅卵石状；细胞表面 CD31分子表达率为98.14％，胞膜上Ⅷ因子高表达，符合HUVEC的特点。
　　2.采用自重弯曲法测得2%双丙烯酰胺和40%丙烯酰胺配比水凝胶的弹性模量为3030±144Pa。
　　3.登革病毒感染可引起血管内皮细胞超微结构的改变：核仁固缩，线粒体髓样变，微绒毛消失以及核膜增厚、空泡化明显。
　　4.内皮细胞增殖率在不同的基底上可出现不同的改变，本研究中发现在水凝胶上的内皮细胞增殖不如在聚乙烯基底上的明显。尽管不同基底上HUVEC的细胞周期与细胞凋亡率无明显差异，但经DENV-2感染后释放的NO水平均较正常未接毒组有所降低，同时ET-1水平较正常未接毒组升高，具有统计学意义。
　　结论:
　　1.基底刚度可影响人原代HUVEC的增殖效率，及释放的NO与ET-1浓度的变化，说明血管内皮受损后，其分泌合成的血管活性物质减少，一定程度上参与了登革热的致病发生。
　　2.水凝胶模型表面光滑平整，为了使细胞更好的粘附其上，采用了IV型胶原蛋白进行耦合，制作过程中加入了APS、TEMED，同时加入BSA，使形成的水凝胶减少材料上的毒性，实验结果也提示没有影响细胞周期与细胞凋亡率的改变、细胞活力的下降。提示该模型实用性尚可，可为在体外研究登革病毒感染提供一定的新思路。

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综述：血管内皮与登革病毒

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