水凝胶培养的原代人脐静脉内皮细胞感染Ⅱ型登革病毒对细胞产生IL-29的影响

摘要

登革病毒（DENV）是一种虫媒病毒，主要是通过白纹伊蚊和埃及伊蚊进行传播，每年约有5000万-5.28亿人口受到感染。DENV感染可以引起登革热（DF）和危及生命的登革出血热（DHF）及登革休克综合征(DSS)，其中DHF/DSS是重症的登革病毒感染，其主要的特征之一是血浆渗漏。目前普遍认为DHF/DSS的发病机制主要包括病毒毒力因素，抗体依赖性感染增强效应（ADE），宿主因素，交叉反应性T细胞介导的免疫病理损伤以及细胞因子风暴等。众多发病机制的提出主要是因为模型的不同，目前小鼠、人血管内皮细胞主要以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为研究DENV感染发病机制的主要模型，但小鼠模型的运用并不能完全模拟人类的感染情况，细胞模型则因作用因素单一也不能确切的反映感染症状。
　　近年来研究发现组织基底硬度是影响细胞功能的主要因素之一，正常生理条件下血管基底膜及下层基质的弹性硬度值影响了多种与血管内皮细胞生存、复制、迁徙和维持稳态的重要生物学功能，不同弹性硬度条件下这些生物学功能水平差异较大。当前利用聚丙烯酰胺凝胶构建不同的组织硬度可以影响细胞的生物学功能，使其能够更贴近生理环境。本实验通过水凝胶模拟人血管内皮细胞基底膜弹性硬度，使体外模型的建立能够更贴近生理环境，为 DENV发病机制的研究提供一个新的研究模型。
　　目的:利用水凝胶(hydrogel)模拟人类血管内皮细胞基底膜弹性硬度,以登革病毒2型(DENV-2)NGC株感染接种于水凝胶为基底的原代 HUVECs,观察HUVECs在水凝胶与普通塑料培养瓶产生IL-29的情况。
　　方法:
　　1.原代人脐静脉内皮细胞的分离、培养及鉴定：从健康新生儿的脐带中分离并培养原代HUVECs,利用免疫组织化学法和流式细胞术鉴定所分离的细胞。
　　2.水凝胶的制备和细胞接种：将原代 HUVECs接种于丙烯酰胺与聚丙烯酰胺混合配制的水凝胶。
　　3.流式细胞术检测细胞凋亡及感染率：以MOI(multiplicity of infection)=10的DENV-2 NGC株感染HUVECs,利用流式细胞术检测48h细胞的凋亡率及病毒的感染率。
　　4.基因芯片检测：提取DENV-2感染48h的接种于水凝胶和普通塑料瓶的原代HUVECs的总mRNA，送检样本进行基因表达谱芯片的检测。
　　5.实时定量PCR(qRT-PCR)及双抗体夹心ELISA法实验：通过实时定量PCR及双抗体夹心ELISA法验证基因芯片检测相关基因的表达情况。
　　结果:DENV-2 NGC株感染培养于水凝胶的原代 HUVECs48h,利用流式细胞术检测证实原代 HUVECs的病毒感染率较低,细胞凋亡率与水凝胶未感染组比较,差异无统计学意义；通过mRNA基因表达谱芯片、实时荧光定量PCR、双抗体夹心ELISA法检测发现IL-29的表达与普通塑料细胞培养瓶接种的原代脐静脉内皮细胞受到病毒感染存在差异。
　　结论:利用DENV-2 NGC株感染接种于水凝胶的脐静脉内皮细胞,通过 mRNA基因表达谱芯片检测发现IL-29的产生,并且与体外正常培养条件下受到DENV-2 NGC株感染后存在差异,可能为DENV的发病机制研究提供新的模型。

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