shRNA真核表达载体干扰多发性骨髓瘤细胞NOTCH1基因表达的实验研究

摘要

目的:应用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的NOTCH1基因表达,研究NOTCH1基因干扰对RPMI8226细胞周期、凋亡、IL-6分泌能力以及对抑癌基因蛋白的影响,探寻多发性骨髓瘤基因治疗的新靶点。
　　方法:(1)针对人NOTCH1的基因序列设计合成四对含有短发夹结构的寡核苷酸序列,将其连入pGPU6/GFP/Neo质粒中,构建NOTCH1 shRNA真核表达载体,经Lipofectamine TM 2000脂质体转染RPMI8226细胞,RT-PCR的方法筛选出最佳干扰的表达载体。
　　(2)应用四唑盐(MTT)法绘制细胞生长曲线,观察NOTCH1 shRNA对RPMI8226细胞增殖的影响;流式细胞仪分析细胞周期分布及细胞凋亡;Western blot检测NOTCH1 shRNA作用后notch1蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p27、p21表达水平的变化。
　　(3)应用固相酶联免疫吸附(ELISA)法检测NOTCH1 shRNA对RPMI8226细胞分泌IL-6的影响;
　　结果:(1)NOTCH1 shRNA转染72小时后,转染效率达60％±2.34%,采用RT-PCR法筛选出最佳的shRNA为NOTCH1-6260,其序列为Sense5'-CACC GGGACATCACGGATCATATGGTTCAAGAGACCATATGATCCGTGATGTCCCTTTTTTG-3',Anti-sense5'-GATCCAAAAAAGGGACATCACGGATCATATGGTCTCTTGAACCATATGATCCGTGATGTCCC-3'。
　　(2)NOTCH1 shRNA转染组,阴性对照组(Neg-shRNA)及空白对照组生长增殖率分别为(49.09±2.31)%、(91.73±2.67)%、(98.10±0.41)%,转染组增殖率明显低于Neg-shRNA组和空白组(p<0.05)。NOTCH1 shRNA转染组、Neg-shRNA对照组、空白对照组的G0/G1期细胞分别为(66.23±3.71)%、(42.27±3.65)%、(40.70±0.92)%,转染组明显高于其他两个对照组(p<0.05);S期细胞分别为(31.03±1.49)%、(56.53±1.76)%、(51.83±1.45)%,转染组明显低于其他两个对照组(p<0.05)。比较Neg-shRNA对照组和空白组,NOTCH1 shRNA转染组的notch-1蛋白表达下调(比空白组下降44.54%),抑癌基因蛋白p27表达上调1.75倍、p21表达上调1.96倍。NOTCH1 shRNA转染组、Neg-shRNA对照组、空白对照组的凋亡率分别为(46.67±1.31)%、(1.37±0.63)%、(0.85±0.43)%,转染组明显高于Neg-shRNA组和空白组(p<0.05)。
　　(3)NOTCH1 shRNA组分泌IL-6的OD值(28.18±3.50),较Neg-shRNA组(167.08±7.97)和空白组(185.86±5.61)明显减低(p<0.05)。
　　结论:(1)应用RNAi技术,NOTCH1-6260可有效地干扰RPMI8226细胞NOTCH1基因的表达。
　　(2)NOTCH1 shRNA可抑制细胞增殖,阻滞RPMI8226细胞于G0/G1期,上调p21、p27分子的表达可能是其机制之一。
　　(3)NOTCH1 shRNA可诱导细胞凋亡。
　　(4)NOTCH1 shRNA可下调与疾病相关的IL-6分泌能力。RNAi技术有望成为多发性骨髓瘤靶向基因治疗的新工具,NOTCH1基因可能成为多发性骨髓瘤靶向基因治疗的新靶点。

目录

封面

声明

目录

缩 略 词 表

中文摘要

英文摘要

前 言

第一部分：NOTCH1基因 shRNA的合成、筛选及沉默效益

1、材料和方法

2、统计分析

3、结果

4、讨论

第二部分：NOTCH1基因shRNA对 RPMI8226细胞增殖、凋亡的影响

1、材料和方法

2、统计分析

3、结果

4、讨论

第三部：NOTCH1基因 shRNA对RPMI8226细胞分泌IL-6的影响

1、材料和方法

2、统计分析

3、结果

4、讨论

结论

参考文献

致谢

综述