大鼠Fas shRNA真核表达载体的构建及其抑制肾小管上皮细胞Fas基因表达的实验研究

摘要

目的: 构建四个Fas shRNA真核表达重组质粒，并检测其对NRK-52E细胞(大鼠肾小管上皮细胞)Fas基因的沉默效率，筛选出一个最有效干扰质粒。然后使用细胞因子刺激NRK-52E细胞，体外模拟肾小管上皮细胞在肾移植急性排斥反应阶段所处的环境。验证该干扰质粒在肾小管上皮细胞高表达Fas基因的情况下对该基因的抑制效果。为进一步研究RNA干扰技术在同种异体肾移植中诱导免疫耐受，保护供肾的作用奠定基础。 方法: 1.Fas shRNA干扰靶点的选择及转录模板DNA链的设计、合成：按照siRNA设计原则，在大鼠Fas基因mRNA上挑选四个干扰靶序列，EGFP的干扰序列采用Carl D.Novina等所提供的已经验证有效的序列；再根据靶序列分别设计并合成两端含有酶切位点的总长度为64bp的shRNA转录模板DNA正、反义寡核苷酸链。 2.pSilencer Fas/EGFP shRNA表达载体的构建：将正、反义寡核苷酸链煺火后克隆至经酶切回收后的空载体pSilencerTM3.1-H1 neo siRNA Expression Vector中。经过PCR、酶切及测序鉴定后对重组质粒分别命名为：pSilencerIFas1 shRNA、pSilencer-Fas2 shRNA、pSilencer-Fas3 shRNA、pSilencer-Fas4 shRNA及pSilencer-EGFP shRNA。 3.用LipofectamineTM LTX Reagent将pSilencer Fas(1.2.3.4)四个重组质粒转染至大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)内，并以pSilencer-EGFP shRNA和pEGFP-N1质粒共转染来做阳性对照，阴性对照采用Ambion公司提供的阴性对照质粒。经过G418压力性筛选后，使用RT-PCR和蛋白免疫印迹法分析针对Fas基因构建的四个重组质粒的有效性，筛选出最有效的干扰质粒。 4.使用重组大鼠干扰素-γ(rr IFN-γ)和重组大鼠肿瘤坏死因子-α(rrTNF-α)刺激NRK-52E细胞，体外模拟肾移植后急性排斥反应阶段肾小管上皮细胞Fas表达情况。分为正常细胞组，单加rr IFN-γ组(终浓度500U/ml)，单加rr TNF-α组(终浓度20ng/ml)，rr IFN-γ和rr TNF-α共刺激组(终浓度分别500U/ml和20ng/ml)四组，进行RT-PCR和蛋白免疫印迹法分析，检测各组对Fas表达最的影响效果。 5.使用筛选出的Fas shRNA干扰质粒转染经细胞因子刺激过的NRK-52E细胞，进行RT-PCR和蛋白免疫印迹法分析，确定其在炎症因子影响下对Fas基因的干扰效果。 结果: 1.PCR、双酶切及测序证实pSilencer-Fas1 shRNA、pSilencer-Fas2 shRNA、pSilencer-Fas3 shRNA、pSilencer-Fas4 shRNA及pSilencer-EGFP shRNA五个莺组子均构建成功。 2.在阳性对照组中，经pSilencer-EGFP shRNA和pEGFP-N1质粒共转染的NRK-52E细胞荧光表达的数量及亮度均明显低于pEGFP-N1单质粒转染组，证明了该载体介导RNA干扰的有效性。其余转染组除pSilencer-Fas1 shRNA转染组及阴性对照组外，Fas基因的mRNA及蛋白表达水平均低于正常细胞组，经过统计分析，最终确定pSilencer-Fas4 shRNA对Fas基因的抑制率最高，分别达到78.9％和64.5％。 3.使用重组大鼠干扰素-γ(rr IFN-γ)和重组大鼠肿瘤坏死因子-α(rr TNF-α)刺激NRK-52E细胞。24-48h后，Fas基因的mRNA及蛋白表达水平均高于正常细胞组，经过统计学分析，认为rr IFN-γ和rr TNF-α共刺激可使NRK-52E细胞Fas基因的表达量提高最显著。在mRNA及蛋白水平分别达到正常细胞的2.37倍和2.53倍。 4.在细胞因子刺激的环境下,psilencer-Fas4 ShRNA 仍能够使NRK-52E细胞Fas基因的mRNA及蛋白表达量下降到正常细胞组的36.4％和44.2％。说明其在炎症因子刺激的环境下，依然能够有效抑制Fas基因的表达。 结论: 利用RNA干扰技术沉默大鼠Fas基因，可以降低大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)Fas的表达；同时在体外模拟肾移植后急性排斥反应阶段，炎症因子刺激的环境下依然能够有效抑制Fas的表达。为进一步研究RNA干扰技术在同种异体器官移植中诱导特异性免疫耐受和保护移植物奠定了基础。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前言

材料与方法

第一部分实验材料

第二部分实验方法

结果

讨论

结论

论文图片

参考文献

综述 RNA干扰在器官移植方面的应用及其在同种异体肾移植方面的发展前景

攻读硕士学位期间发表学术论文题目

致谢