Fas siRNA真核表达载体构建及抑制凋亡作用的实验研究

摘要

目的：构建Fas（CD95）特异性的siRNA真核表达载体psilencircle-FasSi，转染Fas-FasL凋亡途径敏感性细胞株Jurkat，进而研究运用RNAi技术下调Fas的抗凋亡作用。 方法：根据siRNA的设计原则，运用生物信息学设计siRNA靶点，以PCR制备siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)，转染Jurkat细胞，实时定量荧光PCR检测Fas的抑制率，筛选出抑制Fas效率较高的siRNA靶点；将上述筛选出的siRNA序列插入siRNA真核表达质粒psilencircle中，构建psilencircle-FasSi。Psilecircle-FasSi转染Jurkat细胞，实时定量荧光PCR检测Fas的mRNA、Western blot检测Fas蛋白的抑制率；anti-Fas mAb刺激Jurkat细胞凋亡，Annexin-Ⅴ-FITC/PI双色荧光标记，流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果：构建的psilecircle-FasSi StuⅠ酶切电泳，可见4800bp左右的条带，测序结果与设计序列一致，表明psilecircle-FasSi真核表达载体构建成功。Psilecircle-Fas Si转染Jurkat细胞表达后，实时定量荧光PCR检测Fas mRNA、Western blot检测Fas蛋白，与未转染组相比明显抑制了Fas基因的表达；anti-Fas mAb刺激Jurkat细胞凋亡，Annexin-Ⅴ-FITC/PI双色荧光标记，流式细胞术检测凋亡率，转染组Jurkat细胞与未转染组相比，凋亡率明显下降，证明psilecircle-FasSi转染Jurkat细胞后明显抑制了Fas的表达，阻止了Fas-FasL凋亡途径引起的细胞凋亡。 结论：成功构建了Fas特异性siRNA真核表达载体psilencircle-FasSi，抑制了Fas的表达，降低了通过Fas-FasL途径引起的细胞凋亡。