基于mTOR靶标小豆蔻明抑制肿瘤血管生成及其机制的研究

摘要

目的
　　血管生成对肿瘤的生长起着重要的作用,抑制肿瘤血管生成是目前抗肿瘤治疗的主要方法之一。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)是肿瘤生长过程中的重要蛋白,参与调节细胞的代谢和增殖;同时在肿瘤组织血管生成的调控中起着重要作用。前期研究表明小豆蔻明(Cardamonin,CAR)能够靶向作用于mTOR抑制肿瘤生长,但CAR是否影响肿瘤血管生成尚不明确。本课题旨在考察CAR是否通过作用于mTOR靶标抑制肿瘤血管生成,并探讨其可能的机制,为开发以mTOR为靶标的抗肿瘤药物提供实验依据。
　　方法
　　1、实验材料
　　体外:人卵巢癌细胞株SKOV3,体内:鸡胚绒毛尿囊膜(chickenembryoallantoismembrane,CAM)模型。
　　2、分组与给药
　　SKOV3:常氧细胞分为0.1％二甲亚砜(DimethylSulfoxide,DMSO)溶剂对照组,RAP组(10-7mol·L-1),低剂量CAR组(3×10-6mol·L-1)和高剂量CAR组(3×10-5mol·L-1);CoCl2(1.5×10-4mol·L-1)模拟缺氧,缺氧细胞分组与常氧细胞相同。
　　CAM:分为PBS空白组,条件培养液(conditionedmedium,CM)模型对照组,RAP组(10-5mol·L-1),低剂量CAR组(3×10-4mol·L-1),中剂量CAR组(10-3mol·L-1)和高剂量CAR组(3×10-3mol·L-1)。
　　3、测定指标及方法
　　3.1、显微镜观察细胞形态
　　3.2、MTT法测定细胞增殖
　　3.3、半定量RT-PCR法检测缺氧诱导因子1α(hypoxia-induciblefactor1α,HIF1α)、缺氧诱导因子2α(hypoxia-induciblefactor2α,HIF2α)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的mRNA表达
　　3.5、WesternBlot法检测HIF1α、HIF2α、VEGF、mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1蛋白的表达
　　3.6、CAM血管计数
　　结果
　　1、CoCl2模拟缺氧状态下SKOV3细胞增殖受到明显抑制(P<0.01)。在常氧及模拟缺氧状态培养时,CAR可剂量依赖性抑制SKOV3细胞增殖;
　　2、CAR抑制mTOR和S6K1活化,显著性降低p-mTOR、p-S6K1的蛋白表达(P<0.01),其中高剂量组CAR的抑制作用较强;而CAR对二者总蛋白的表达无显著性影响;
　　3、CAR降低缺氧诱导的HIF1α和HIF2α蛋白表达(P<0.01),高剂量组CAR的抑制作用较弱,且在常氧状态下增强HIF1α表达(P<0.01);CAR对HIF1α和HIF2αmRNA表达的影响不明显;
　　4、在常氧及缺氧状态下,CAR能降低VEGF的mRNA和蛋白表达(P<0.01);高剂量与低剂量CAR对VEGFmRNA的降低作用无显著差异;而高剂量CAR对VEGF蛋白表达的抑制作用较低剂量CAR强;
　　5、CAR可剂量依赖性抑制CM刺激引起的CAM血管生成(P<0.01)。
　　结论
　　1、CAR可通过mTOR影响HIF1α、HIF2α和VEGF的表达;
　　2、CAR可能以非mTOR依赖的方式影响HIF1α、HIF2α和VEGF的表达;
　　3、CAR能够抑制生长因子刺激引起的血管生成。

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封面

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英文缩略词对照表

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

1.1动物与细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要试剂配制

1.4 主要仪器

2 方法

2.1 SKOV3细胞培养

2.2 四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞增殖

2.3 半定量RT-PCR

2.4 蛋白含量测定

2.5 Western blot检测目的蛋白表达

2.6 CAM模型

3 统计学分析

结果

一、小豆蔻明对常氧及CoCl2模拟缺氧培养状态下SKOV3细胞形态的影响

二、小豆蔻明对常氧及CoCl2模拟缺氧培养状态下SKOV3细胞增殖的影响

三、小豆蔻明对常氧及CoCl2模拟缺氧培养状态下SKOV-3细胞HIF1α、HIF2α、VEGF mRNA表达的影响

四、小豆蔻明对常氧及CoCl2模拟缺氧培养状态下SKOV3细胞mTOR信号通路及血管生成相关蛋白表达的影响

五、 小豆蔻明对鸡胚尿囊模型血管生成的影响

讨论

结论

参考文献

致谢

综述

参考文献

作者简历