ADAM10基因缺失对成年小鼠大脑Aβ肽的产生和认知功能的影响

摘要

目的:淀粉样前体蛋白(APP)经过β-分泌酶和γ-分泌酶水解,释放出Aβ肽。Aβ肽是淀粉斑的核心成分,它的过多生成或聚集被认为是阿尔茨海默病致病的主要原因。APP蛋白还有另一条非淀粉样蛋白加工途径,在这条途径中,它被α-分泌酶和γ-分泌酶连续水解。由于α-分泌酶的水解APP位点在Aβ肽内部,因此,可以减少Aβ肽的生成。目前,已经证实去整合素和金属蛋白酶10(ADAM10)是神经元的组成型APPα-分泌酶。但是,ADAM10缺失究竟对成年神经细胞的功能造成何种影响迄今不清楚,为此,我们利用本室建立的成年大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠(ADAM10cKO)模型研究ADAM10基因缺失对APP代谢水平和小鼠学习记忆的影响。
　　方法:利用PCR方法鉴定ADAM10cKO小鼠的基因型。鉴定出的纯合子小鼠用于后续的实验研究。按照常规的组织学方法,取3、6、9和12月龄ADAM10cKO小鼠和野生型C57BL/6J小鼠(WT)的大脑,经过固定、脱水、透明、石蜡包埋、切片和HE染色,观察ADAM10cKO小鼠和WT小鼠大脑海马和皮层组织的形态结构,以及皮层第5层和海马神经元数量的变化。分别取7、9、11、12、13和15月龄ADAM10cKO小鼠和ADAM10Fl/Fl对照小鼠的大脑,经过固定、脱水、透明、石蜡包埋、切片和免疫组织化学染色,观察β淀粉样蛋白(Aβ)在大脑皮层和海马组织中的分布,并分析Aβ沉积与年龄的关系。分别提取20月龄的ADAM10cKO小鼠和ADAM10Fl/Fl小鼠的皮层和海马组织蛋白,采用Westernblotting方法定量测定APP和Aβ肽的含量,分析ADAM10基因缺失对APP代谢的影响。分别取10月龄ADAM10cKO小鼠和WT小鼠各9只进行水迷宫实验,通过检测逃避潜伏期、目标象限(原先放置平台的象限)停留的时间百分比和1min内穿过平台次数评价两组小鼠的学习和记忆能力。
　　结果:HE染色结果表明,3、6、9和12月龄ADAM10cKO小鼠大脑皮层和海马的形态结构未见明显异常,但是,皮层第Ⅴ层的神经元数量随着年龄的增大而减少,海马神经细胞减少更为明显。免疫组织化学实验结果显示,7、9、11、13和15月龄ADAM10cKO小鼠与同龄的ADAM10Fl/Fl对照小鼠相比,其大脑皮层和海马未见淀粉斑,但在神经细胞内可溶性Aβ肽呈年龄依赖性增加。可溶性Aβ肽的含量在两种小鼠的海马和皮层的神经细胞中表现出差异。Westernblotting实验结果表明,ADAM10cKO小鼠与ADAM10FL/FL小鼠比较,其成熟与非成熟的全长APP蛋白含量在海马中分别减少73.0％和62.3%(P﹤0.01),但是,在大脑皮层中,成熟与非成熟的全长APP蛋白含量变化不明显;ADAM10cKO小鼠大脑皮层和海马中Aβ肽总含量分别增加20.45%和27.21%(P<0.05和P<0.01),皮层中Aβ1-38、Aβ1-40和Aβ1-42肽的含量分别增加32.85%、25.37%和80.95%(P<0.05,P<0.05和P<0.01),海马中Aβ1-38、Aβ1-40和Aβ1-42肽的含量分别增加41.67%、38.36%和22.22%(P﹤0.05),呈现明显差异。水迷宫实验结果显示,在训练期间,ADAM10cKO小鼠的平均潜伏期比WT小鼠的时间长,第2天和第3天分别表现出明显差异(P﹤0.05和P﹤0.01)。在测试期间,ADAM10cKO小鼠和WT小鼠相比,其平均穿越平台的次数少,并且,平均停留目标象限时间的百分比低,均呈现明显差异(P﹤0.05)。
　　结论:ADAM10基因缺失导致成年小鼠大脑皮层和海马的神经细胞数目明显减少。APP含量在大脑皮层中无变化,而在海马中明显减少,可能是海马神经元过多丢失所致。可溶性Aβ肽含量呈年龄依赖性增加,是神经退化和认知功能受到损害的主要原因。

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第一章 前言

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.2方法

第三章 结果

3.1基因型鉴定

3.2 HE染色

3.3免疫组织化学

3.3.Western blotting的实验结果

3.4水迷宫

第三章 讨论

参考文献

致谢

Alzheimer相关的α-分泌酶ADAM10的研究进展