小片段干扰RNA沉默Molt-4细胞DNMT1基因对组蛋白调控的实验研究

摘要

目的:DNMT1小片段RNA干扰人急性T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞的DNMT1(DNA methyltransferase 1)基因的表达,研究DNMT1基因干扰对Molt-4细胞增殖、细胞凋亡以及对组蛋白甲基化、乙酰化调控的影响,探讨白血病基因治疗的新靶点。
　　方法:(1)设计针对DNMT1基因的4个小干扰RNA片段,经阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000转染Molt-4细胞后,应用RT-PCR筛选出最佳DNMT1干扰片段。
　　(2)应用MTT法绘制细胞生长曲线,观察DNMT1 siRNA对Molt-4细胞增殖的影响;应用流式细胞术分析细胞的凋亡。
　　(3)应用蛋白免疫印迹法检测Bcl-2、procaspase-3、P15蛋白表达水平以及组蛋白H3K4、H3K9甲基化、组蛋白H3乙酰化状态的改变。
　　结果:(1)人DNMT1最佳的siRNA序列为Sense 5'-GCACCUCAUUUGCCGAAUATT-3'Antisense 5'-UAUUCGGCAAAUGAGGUGCTT-3'。DNMT1siRNA转染Molt-4细胞后可沉默该基因表达,并呈现浓度依赖性。
　　(2)DNMT1 siRNA抑制Molt-4细胞增殖,且随着浓度增加、作用时间延长,抑制率也逐渐上升。
　　(3)DNMT1 siRNA下调Molt-4细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、procaspase-3的表达,诱导细胞凋亡。
　　(4)DNMT1 siRNA沉默Molt-4细胞的DNMT1蛋白及DNMT1 mRNA表达,上调P15的表达;下调组蛋白H3K9甲基化水平,上调组蛋白H3K4的甲基化水平,而组蛋白H3乙酰化水平无明显变化。
　　结论:(1)阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000介导DNMT1 siRNA导入Molt-4细胞,具有操作步骤简单、转染率高的特点。
　　(2)运用RNAi技术,DNMT1 siRNA可以有效地抑制Molt-4细胞中DNMT1的表达,使P15从新表达,抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。
　　(3)DNMT1 siRNA下调组蛋白H3K9甲基化水平,上调组蛋白H3K4的甲基化水平,这是启动基因转录的标志。DNMT1有望成为白血病基因治疗的新靶点,其机制有待进一步研究。

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缩略词表

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前言

第一部分 DNMT1基因 siRNA的合成、筛选及沉默效益

1 材料和方法

1.1 仪器

1.2 主要试剂

1.3 细胞株与培养体系

1.4 靶序列的选择

1.5 转染

1.6 转染效率的测定

1.7 RT-PCR法检测Molt-4细胞DNMT1 mRNA表达

1.8 DNMT1 siRNA干扰后DNMT1蛋白的表达检测。

1.9 统计学分析

2.结果

2.1 转染效果和转染率的计算

2.2 DNMT1基因的最佳siRNA干扰片段筛选

2. 3 DNMT1 siRNA对DNMT1 mRNA表达的影响

2.4 DNMT1 siRNA对DNMT1蛋白表达的影响

3 讨论

第二部分DNMT1基因 siRNA对Molt-4细胞增殖、凋亡的影响

1 材料和方法

1.1 仪器

1.2 主要试剂

1.3 细胞株与培养体系

1.4 MTT法绘制细胞的生长曲线

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

1.6 Western Blot法检测DNMT1 siRNA干扰后凋亡相关蛋白及细胞周期调控蛋白P15的表达；实验分组及实验方法同第一部分。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 DNMT1 siRNA抑制Molt-4细胞增殖

2.2 DNMT1 siRNA诱导Molt-4细胞凋亡

2.3 DNMT1 siRNA对凋亡相关蛋白及P15的影响

3 讨论

第三部分 DNMT1基因 siRNA对Molt-4细胞组蛋白调控的影响

1材料和方法

1.1仪器

1.2试剂

1.3细胞培养及siRNA的转染

1.4 Western Blot法检测DNMT1 siRNA干扰后组蛋白H3K4、H3K9甲基化，H3乙酰化状态的变化；实验分组及实验方法同第一部分。

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

致谢

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参考文献