ATF3在肠癌细胞HCT116中生物学作用及蛋白酶体抑制剂Carfilzomib对ATF3的调节

摘要

目的：全球范围内，结直肠癌致死位居肿瘤死因第四位，尽管如今结直肠癌的诊断以及治疗水平有所提高，其5年生存率也只有53.8-65.2％。ATF3蛋白属于ATF/CREB转录因子家族成员具有碱性亮氨酸拉链结构（bZip）,作为一种转录活化因子在肿瘤中起着致癌基因还是抑癌基因作用存在争论。本研究通过慢病毒介导ATF3在结直肠癌细胞HCT116中过表达，探讨ATF3在HCT116细胞中对其增殖、肿瘤起始能力、转移侵袭以及上皮间质转化（EMT）生物学作用，并初步探讨可能的分子机制,探讨蛋白酶体抑制剂Carfilzomib对HCT116的细胞毒作用以及对ATF3的调节。
　　方法：构建慢病毒介导的ATF3表达载体并感染HCT116，puro筛选出稳定ATF3过表达的HCT116细胞株HCT116/ATF3和阴性对照HCT116/Control。应用MTS细胞活性分析、FACS细胞周期检测、FACSAnexinⅤ-7-AAD、克隆形成实验来检测细胞增殖能力；应用细胞球囊形成实验以及FACS检测细胞肿瘤起始能力；应用划痕实验、Transwell转移分析和Transwell侵袭分析来检测细胞转移侵袭能力；应用光学显微镜观察细胞形态变化鉴定细胞EM T；用Western Bloting和real-time qPCR来检测相关基因的mRNA及蛋白表达情况。
　　结果：MTS细胞活性检测增殖能力以及克隆形成实验克隆数在HCT116/ATF3细胞明显低于对照细胞HCT116/Control（p<0.05）；real-time qPCR和Western Blot检测到HCT116/ATF3细胞survivin、cyclinD1、PCNA表达下调以及PARP表达上调。HCT116/ATF3细胞形成的细胞球囊平均直径和数量以及CD133+CD24+细胞群的百分比明显低于对照细胞（p<0.05）；qRT-PCR和Western Bloting检测到HCT116/ATF3细胞CD133、CD24、Ep-CAM、CD166、ID1、beta-catenin和EZH2表达下调。HCT116/ATF3细胞创伤愈合划痕实验创伤愈合程度、Transwell迁移分析与Transwell侵袭实验的细胞穿过数明显低于对照细胞（p<0.05）；real-time qPCR和Western Blot检测到HCT116/ATF3细胞MMP2和MMP9表达下调以及TIMP2和TIMP1表达上调。光学显微镜观察细胞形态HCT116/ATF3细胞形态由间质细胞向上皮细胞转化（MET）；Western Blot检测到HCT116/ATF3细胞E-cadherin表达上调和snail、slug和twist表达下调。通过MTS细胞活性检测HCT116生长随Carfilzomib剂量增加而受到抑制，细胞周期检测Carfilzomib作用后HCT116主要停滞在G0/G1期；FACSAnexinⅤ-7-AAD检测HCT116凋亡随Carfilzomib剂量增加而增加。通过real-time qPC R和Western Blot检测到Carfilzomib诱导ATF3表达具有时间依赖性。
　　结论：应用慢病毒介导基因转染成功构建ATF3稳定表达HCT116细胞模型HCT116/ATF3和对照细胞HCT116/Control；ATF3通过下调survivin、cyclinD1、PCNA以及上调PARP来抑制HCT116细胞增殖；ATF3通过下调CD133、CD24、Ep-CAM、CD166、ID1、beta-catenin和EZH2来抑制HCT116肿瘤起始能力；ATF3通过下调MMP2和MMP9以及上调TIMP1和TIMP2来抑制HCT116细胞迁移侵袭能力；ATF3通过上调E-cadherin和下调snail、slug和twist逆转HCT116EMT；蛋白酶体抑制剂Carfilzomib可上调HCT116中ATF3的表达并抑制HCT116细胞生长。

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前言

第一部分A T F 3过表达对HCT116细胞增殖，肿瘤起始能力以及相关信号通路的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 AT F3过表达对HCT116细胞转移侵袭能力、EMT以及相关信号通路的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 蛋白酶体抑制剂Carfilzomib对ATF3的调节

材料与方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

致谢

综述

参考文献