α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)诱发高致瘤性干细胞样乳腺癌细胞机制研究

摘要

目的：研究α-KG类似物α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上调缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）诱发高致瘤性干细胞样乳腺癌细胞的发生机制。
　　方法：通过体外常氧或缺氧条件下的细胞培养，应用细胞集落形成试验、台盼蓝拒染试验、三磷酸腺苷(ATP)定量试验、乳腺细胞球形成试验、报告基因质粒构建及双萤光素酶报告基因检测法、Western分析、小干扰RNA(siRNA)转染、实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、半定量巢式RT-PCR、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、免疫荧光染色和成像及流式细胞术、以及体外动物实验进行肿瘤异体移植等技术手段，研究DM-2KG对乳腺癌细胞的作用。
　　结果：⑴α-KG作为PHDs的辅助因子，可激活PHDs，促进HIF-1α的降解，但是具有跨膜渗透能力的DM-2KG区别于另一种α-KG类似物octyl-2KG，其在常氧条件下，不仅没有促进HIF-1α的降解，反而特异性提高HIF-1α蛋白水平，并能进一步激发HIF-1α下游目标基因，如GLUT1、VEGF和PDK1等的表达。⑵DM-2KG是通过抑制HIF-1α蛋白的降解环节而上调其表达水平。⑶DM-2KG促进HIF-1α蓄积是通过抑制PHD2介导的HIF-1αPro564羟基化实现的。⑷DM-2KG可以通过诱导p21基因表达，抑制乳腺癌细胞增殖并诱发产生具可逆性生长的静止期癌细胞。⑸经过较长周期DM-2KG培养后，DM-2KG还可以诱导乳腺癌细胞高表达肿瘤干细胞标志物CD44，从而使这类癌细胞具备干细胞的表型。⑹经DM-2KG预处理后的MDA-MB-231细胞的体外和体内的成瘤能力均明显增强，这组细胞符合肿瘤干细胞的生物学特性。⑺当用shRNA敲减乳腺癌细胞HIF-1α表达后，p21和CD44表达、DM-2KG诱发的高致瘤性均将受抑制，提示DM-2KG诱发乳腺癌细胞的静止期和干细胞样表型具有HIF-1α依赖性的特点。
　　结论：DM-2KG可以通过抑制PHD2功能，上调HIF-1α蛋白水平，从而抑制乳腺癌细胞增殖，并诱发产生一表达CD44-high和Ki67-low、具静止期和干细胞样特点及高致瘤性的癌细胞亚群。PHD2-HIF-1α通路有可能成为乳腺癌干细胞治疗的潜在新靶点，从而克服乳腺癌对传统放化疗的耐药问题。DM-2KG有望在肿瘤干细胞研究领域发挥更加重要的作用。

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缩略词

引言

材料方法

细胞和试剂

Western 分析和抗体

衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色

VEGF-报告基因分析

实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）

小干扰RNA (siRNA)转染和半定量巢式RT-PCR

细胞集落形成试验

台盼蓝拒染试验

三磷酸腺苷(ATP)定量试验

双萤光素酶报告基因检测法

免疫荧光染色和流式细胞术

免疫荧光染色和成像

乳腺细胞球形成试验

肿瘤异体移植

统计方法

Table 1: 所用引物序列表

结果

1. DM-2KG抑制乳腺癌细胞生长并诱发一亚组静止期癌细胞

2. DM-2KG诱导乳腺癌细胞高表达p21和CD44，促进其形成静止休眠样和肿瘤干细胞样细胞表型

3. 在常氧条件下DM-2KG可提高细胞内HIF-1α蛋白水平

4. DM-2KG和octyl-2KG对细胞内HIF-1α蛋白水平的影响作用相反

5. DM-2KG通过阻止PHD2依赖的脯氨酸羟基化抑制HIF-1α降解

6. DM-2KG诱发乳腺癌细胞静止休眠状态和干细胞样表型是通过HIF-1α介导的

7. DM-2KG通过HIF-1α介导提高了乳腺癌细胞的体外乳腺球形成能力和体内致瘤能力

讨论

参考文献

致谢

综述： 乳腺癌干细胞研究现状