HBx通过EGR1上调mPGES-1表达在促肝细胞炎性反应中的作用

摘要

目的：乙肝病毒（HBV）的X基因表达产物X蛋白（HBx）在肝脏炎性进展过程中发挥多方面的功能，包括调节信号转导、细胞周期、细胞生长和凋亡，细胞的侵袭和转移等。许多肿瘤细胞在体内外均能使前列腺素类物质尤其是前列腺素E2（PGE2）合成增加，而过度增高的PGE2具有促进肿瘤细胞增殖、迁移，以及抑制肿瘤细胞凋亡和宿主免疫功能的能力。近年来关于COX-2调节通路的研究也越来越多，COX-2特异性抑制剂的使用也越来越多，但是抑制COX-2也影响COX-2通路上其它产物的合成，如PGI2和TxA2是天然的抗凝血物，而血栓素TxA2具有血管收缩和血小板聚集作用。选择性的抑制COX-2会改变这两种介质的比率，向TxA2倾斜，导致血管疾病的发生，如突发性心肌梗塞和血栓形成。最新研究显示DMC可以通过下调mPGES-1启动子活性而有效抑制mPGES-1的表达，同时即使其在高浓度时也无COX酶的抑制活性，表明它是比COX-2抑制剂更好的化合物，有望开发成治疗炎症和癌症的药物，针对mP GES-1的研究已成为最近几年来的热点问题。
　　方法：Western blot和qRT-PCR检测mPGES-1在表达HBx蛋白的HL7702-HBx细胞株和不表达 HBx蛋白的 HL7702细胞株中RNA及蛋白表达情况；构建mPGES-1启动子不同长度的短截荧光报告基因及运用基因定点突变技术构建突变型mPGES-1启动子荧光报告基因探寻HBx影响转录的启动子区域；凝胶迁移阻滞实验（EMSA）和染色质免疫共沉淀（ChIP）验证HBx通过EGR1影响mPGES-1启动子转录活性；构建该EGR1的真核表达载体以及运用RNA干扰技术探讨该转录因子EGR1对mPGES-1启动子转录的效果；ELISA法检测HBx及EGR1转录因子对于肝细胞分泌炎性因子PGE2的作用效果。
　　结果：HL7702-HBx细胞株中mPGES-1的RNA及蛋白表达明显高于HL7702(P＜0.05)；HBx通过作用mPGES-1启动子其实转录位点上游-177bp内的EGR1位点调控 mPGES-1基因的转录；上调和干扰EGR1的表达均影响mPGES-1的转录和蛋白表达(P＜0.05)；HBx及EGR1均可以促进HL7702细胞分泌PGE2(P＜0.05)。
　　结论：1.HBx通过影响转录因子EGR1使得mPGES-1启动子转录活性升高并促进蛋白的表达；2.上调EGR1在细胞内的表达可以促进 mPGES-1启动子的转录活性及蛋白表达，但上调EGR1在细胞内的表达对COX-2的转录活性及蛋白表达的影响无显著性差异；下调EGR1在细胞内的表达可以抑制mPGES-1启动子的转录活性及蛋白表达，但下调EGR1在细胞内的表达对COX-2的转录活性及蛋白表达的影响无显著性差异3.HBx及EGR1均可以上调HL7702细胞株分泌PGE2。

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前言

材料与试剂

1.主要试剂

2.细胞株及菌株：

3.主要仪器：

实验方法

1.质粒构建

2.细胞培养和转染

3. 双荧光报告基因检测

4.蛋白免疫印迹法（Western Blot）

5. RNA抽提和实时定量PCR

6 电泳迁移率变动分析（EMSA）

7 染色质免疫共沉淀(ChIP)

8. RNA干扰分析

9. PGE2的检测

10.统计学方法

结果

1. HBX蛋白上调7702细胞mPGES-1启动子的转录活性及mPGES-1蛋白表达

2. EGR-1在HBX上调mPGES-1表达中起着重要作用

3. EGR1影响mPGES-1启动子转录活性但对COX-2的转录活性无影响

讨论

结论

参考文献

综述

参考文献