粪肠球菌胶原黏附素基因转化变异株在留管相关泌尿道感染中的致病作用

摘要

目的：
　　构建粪肠球菌胶原黏附素ace基因转化变异株；建立小鼠留管相关泌尿道感染模型；探讨粪肠球菌ace基因在生物膜形成及泌尿道感染中的致病作用，为防治耐药肠球菌感染研究奠定基础。
　　方法：
　　1.粪肠球菌ace基因转化变异株的构建及鉴定：
　　用PCR方法筛选ace-粪肠球菌野生株N8ace-（壮观霉素敏感）；采用简便法（CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit）处理粪肠球菌N8ace-，使其成为感受态细胞；提取大肠杆菌XL1-Bluep TEX5646质粒（pAT392穿梭质粒，含整段ace基因片段，携壮观霉素抗性）；通过电转化方法将质粒pTEX5646转入粪肠球菌N8感受态中，将电击混合液接种至SR选择培养基上培养，挑选菌落进行药敏试验、PCR鉴定；
　　2.小鼠留管相关泌尿道感染模型建立及评价
　　通过铂固化硅胶管与胰岛素针头于小鼠膀胱中注50ul粪肠球菌标准株ATCC29212菌液（1.5×109cfu/ml）并留置硅胶管24h，脱臼处死小鼠，通过膀胱GM-CSF、IL-6、MIP-1a等细胞因子检测和HE染色病理切片评价模型的建立。
　　3.粪肠球菌ace基因阴性野生株及阳性转化变异株在体外黏附能力的比较
　　挑取野生株N8ace-和转化变异株N8ace+接种到5 ml ELB液体培养基中；分别37℃和46℃250rp m摇菌16h；菌液100 ul分别接种到96孔板，孵化、番红染色、漂洗、干燥后用酶标仪测定孔板底部OD值（OD595）；通过测定OD值，比较ace基因阴性野生株与转化变异株在体外的早期黏附能力。
　　4.粪肠球菌ace基因阴性野生株及阳性转化变异株在小鼠留管相关泌尿道感染模型中的致病作用比较
　　比较野生株与转化变异株在小鼠膀胱和硅胶管表面细菌计数、细胞炎症因子及病理切片的差异；同时用扫描电镜比较导尿管和膀胱表面粪肠球菌黏附聚集情况的差异。
　　结果：
　　1.粪肠球菌ace基因变异株接种于含有100 mg/L的壮观霉素 ELB固体培养基长出白色菌落，未经电击的对照组无菌落长出；PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳图谱中有一大小约为300bp的清晰条带，与设计的ace基因引物大小相符。
　　2.小鼠泌尿道感染模型建立及评价：模型小鼠膀胱病理组织HE染色，显示有炎性细胞浸润，移行上皮细胞肿胀；粪肠球菌标准株组细胞因子GM-CSF、IL-6、MIP-1a浓度分别为223.672±4.748ng/L、284.318±7.642ng/L、123.591±3.967ng/L高于对照小鼠膀胱细胞因子浓度(171.6449±2.462 ng/L、236.917±3.748ng/L、81.462±2.091ng/L)；
　　3.粪肠球菌ace野生株及阳性转化株初步黏附能力 OD595测定：37℃培养下，转化变异株与野生株的早期黏附OD595值无差异（0.00462±0.001652与0.00478±0.001381，p>0.05）；46℃培养下，转化变异株早期黏附 OD595值（0.00557±0.003721）大于野生株的OD595值(0.00460±0.002714，p>0.05)；
　　4.粪肠球菌ace基因野生株及阳性转化株在小鼠留管相关泌尿道感染模型中的致病作用比较
　　（1）变异株N8ace+；转化株组细菌计数略高于野生株组，有统计学意义；（2）转化株组炎症因子GM-CSF、MIP-1a浓度略高于野生株组，有统计学意义；IL-6浓度无统计学意义；（3）膀胱病理组织观察无明显差异性；（4）转化株组扫描电镜观察粪肠球菌黏附于硅胶管细菌更密集，实验组在膀胱表面观察到生物膜表面细菌比对照组更加密集；
　　结论：
　　1.成功构建粪肠球菌ace基因转化变异株；2.成功建立小鼠泌尿道留管感染模型；3.体外黏附实验说明ace基因有利于粪肠球菌生物膜形成的早期黏附；4.ace基因有利于粪肠球菌在膀胱或硅胶管表面的黏附，在留管相关泌尿道感染中有致病作用。

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中英文对照

中文摘要

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前言

材料和方法

（一）菌株、动物和材料

（二）主要仪器设备

（三）主要试剂

（四） 主要溶液的配制

二、 方法

（一） 粪肠球菌 ace基因转化变异株的构建及鉴定

（二）小鼠留管相关泌尿道感染模型的建立及评价

（三）粪肠球菌野生株N8ace﹣与转化变异株N8ace+早期黏附能力的比较

（四）粪肠球菌野生株N8ace﹣与转化变异株N8ace+在小鼠泌尿道感染模型中的致病性比较

结果

一、粪肠球菌ace+变异株构建及鉴定

二、小鼠留管相关泌尿道感染模型的建立及评价

三、 野生株与转化变异株早期黏附能力的比较

四、野生株N8和变异株N8ace+在留管泌尿道感染中的致病性比较

讨论

一、转化变异株构建

二、小鼠泌尿道留管感染模型的建立

三、粪肠球菌ace基因的致病作用

小结

参考文献

致谢

综述

参考文献