细胞外Ca2+浓度的变化对人晶状体上皮细胞内质网应激影响的研究

摘要

目的：本研究拟用改变细胞外Ca2+浓度的方法，探讨内质网应激（ehdoplasmic reticulum stress，ERS）及其介导的凋亡在白内障中的可能发病机制。
　　方法：1.采用不同浓度钙培养液（正常培养液、增加钙浓度1.0、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0mmol/L培养液）培养人LECs24h。采用Flou-3钙荧光探针负载后应用流式细胞术观察细胞内游离Ca2+浓度的变化。
　　2.应用免疫荧光（IF）技术及蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测细胞外Ca2+浓度变化对calpain-2表达的影响。
　　3. Western Blot方法测细胞外Ca2+浓度变化对GRP78、caspase-12表达的影响。
　　4.采用DAPI染色法观察细胞核的形态学变化，分析细胞外Ca2+浓度变化对细胞凋亡率的影响。
　　结果：1.流式细胞术示钙处理组细胞内Ca2+平均荧光强度值增高。随着培养液Ca2+浓度增加，与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。
　　2.免疫荧光及Western blot显示，随着培养液Ca2+浓度升高，calpain-2表达逐步增高，与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。
　　3. Western Blot结果显示，GRP78、caspase-12蛋白的表达较未处理组逐渐升高，与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。
　　4. DAPI显示钙处理组细胞随着培养液Ca2+浓度升高，细胞核表现出典型的凋亡形态学特征的细胞数增多。培养液增加钙浓度为1.0mmol/L时，细胞凋亡率无明显变化，与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）；培养液增加钙浓度为5.0mmol/L，凋亡率增高，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；随着培养液Ca2+浓度进一步增高，凋亡率升高，各组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
　　5.钙处理组细胞内游离Ca2+增高的程度与GRP78的表达呈正相关r=0.952，P<0.05；凋亡率与calpain-2及caspase-12的表达呈正相关，r值分别为0.912，0.940，P值都小于0.01。
　　结论：1.体外培养的人LECs外Ca2+浓度升高，细胞内游离Ca2+增多，calpain-2表达增高。
　　2.体外培养的人LECs外Ca2+浓度轻度升高，激活了calpain-2以及内质网应激，但是尚未对细胞的凋亡产生影响；细胞外Ca2+浓度异常增高，细胞内质网应激无法适应，细胞发生凋亡。
　　3.细胞外Ca2+浓度增高时，诱导的内质网应激激活了calpain-2以及caspase-12传导系统从而导致晶状体上皮细胞凋亡的发生，这可能是白内障的发病机制之一。

目录

封面

声明

目录

英、汉缩略名词对照表

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

1.1 实验对象

1.2 主要试剂及其来源

1.3 主要试剂的配制

1.4 主要仪器及其来源

1.5 实验器皿的准备

2 实验方法

2.1 人晶状体上皮细胞（LECs）的培养

2.2 流式细胞术检测人LECs细胞内游离Ca2+变化

2.3 免疫荧光法检测人LECs calpain-2的表达以及DAPI染色法检测对人LECs凋亡的影响

2.4 western blot检测人LECs calpain-2,GRP78,caspase-12的表达

2.5 统计学分析

结果

1 体外培养人晶状体上皮细胞的形态学观察和鉴定

2 流式细胞术检测人LECs内游离Ca2+变化

3 免疫荧光法检测人LECs calpain-2的表达变化

4 DAPI染色法观察人LECs凋亡的形态学改变(图7、表3、图8)

5 western blot检测人LECs calpain-2，caspase-12,GRP78的表达

6 相关性分析

讨论

结论

参考文献

致谢

论文发表情况：

综述