Akt特异性抑制剂对小鼠植入前胚合子基因组激活的影响

摘要

目的：
　　通过观察Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚体外发育的影响及Akt特异性抑制剂对体外发育2-细胞胚内Akt主要活性形式p-Ser473-Akt定位与表达的改变，结合Akt特异性抑制剂API-2对小鼠合子基因组激活（Zygotic Gene Activation,ZGA）中四个标志基因和干细胞因子Oct4与Sox2的表达影响，为进一步探讨Akt在小鼠植入前胚发育ZGA中可能发挥的作用提供基础。
　　方法：
　　1.收集KM小鼠体内植入前胚（1-细胞胚至4-细胞胚），应用免疫荧光技术观察细胞内p-Ser473-Akt和总Akt（pan-Akt）的表达与定位情况。
　　2.收集KM雌性小鼠与KM雄性小鼠交配所得的1-细胞胚，分别观察其在KSOM培养液、不同浓度的API-2和MK2206的KSOM培养液中体外发育的情况；
　　3.收集KM小鼠1-细胞胚，分别置于KSOM和含API-2（2μM）和MK2206（30μM）的KSOM培养液中培养，获取体外发育的2-细胞胚，采用免疫荧光技术观察细胞内p-Ser473-Akt和pan-Akt的定位与表达情况；
　　4.收集KM小鼠1-细胞胚，分别置于KSOM和含API-2（2μM）的KSOM培养液中培养，获取体外发育的2-细胞胚，运用Real-Time PCR技术检测Hsp70.1、Zscan4d、MuERV-L和eIF-1A等ZGA标志基因mRNA的表达水平。
　　5.收集KM小鼠1细胞胚，分别置于KSOM和含API-2（2μM）的KSOM培养液中培养，获取体外发育的2-细胞胚，运用Real-Time PCR技术检测干细胞因子Oct4和Sox2的mRNA表达水平。
　　结果：
　　1.p-Ser473-Akt和pan-Akt存在于小鼠植入前胚的1-细胞至4-细胞阶段。作为Akt主要的活性形式，p-Ser473-Akt在小鼠1-细胞胚至4-细胞胚内定位存在动态变化，其在1-细胞胚和2-细胞胚期间核内出现的时间与ZGA发生的时相（minor ZGA和major ZGA）基本一致。pan-Akt主要分布在胞质里，在不同发育阶段的细胞中其表达和定位没有发生明显的改变；
　　2.Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚的体外发育具有明显的抑制作用，呈剂量依赖性。一定浓度的API-2（2.0μM）和MK2206（30μM）均可使体外培养的1-细胞胚出现―2-细胞阻滞‖现象；
　　3.2.0μM API-2和30μM MK2206阻滞的2-细胞胚内，p-Ser473-Akt在细胞核内的表达发生了明显的下调，而pan-Akt的定位与表达并没有产生明显的变化；
　　4.2.0μM API-2诱导阻滞的2-细胞胚内，MuERV-L和eIF-1A的mRNA水平明显低于KSOM对照组（P＜0.05），而其他基因的mRNA水平与KSOM组比较，没有明显差别（P＞0.05）。
　　5.2.0μM API-2诱导阻滞的2-细胞胚内，干细胞因子Oct4的mRNA水平明显低于KSOM对照组（P＜0.05），而Sox2的mRNA水平与KSOM组比较，没有明显差别（P＞0.05）。
　　结论：
　　Akt主要活性形式p-Ser473-Akt在小鼠1-细胞胚至4-细胞胚内定位存在动态变化，其在1-细胞胚和2-细胞胚期间核内出现的时间与ZGA发生的时相（minor ZGA和major ZGA）基本一致，提示p-Ser473-Akt可能参与ZGA过程。Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚的体外发育具有明显的抑制作用，一定浓度的API-2（2.0μM）和MK2206（30μM）均可使体外培养的1-细胞胚出现―2-细胞阻滞现象，同时，也使2-细胞胚核内p-Ser473-Akt表达水平下降。且一定浓度的API-2（2.0μM）使2-细胞胚内ZGA标志基因MuERV-L和eIF-1A，以及干细胞因子Oct4的mRNA水平明显下调。这些结果进一步证实，Akt特异性抑制剂诱导产生的―2-细胞阻滞‖，以及ZGA启动失败和干细胞因子Oct4表达下调与其降低核内p-Ser473-Akt表达水平有关。

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前言

材料和方法

1.材料

1.1 实验动物

1.2主要实验仪器、试剂和耗材

1.3 Akt特异性抑制剂配制

1.4 免疫荧光染色相关试剂配制

1.5引物设计、合成、保存与配制

1.6 qRT-PCR相关试剂配制

2方法

2.1小鼠植入前胚（1-细胞胚 至4-细胞胚）的收集

2.2小鼠1-细胞胚的体外培养

2.3 免疫荧光实验操作步骤

2.4 Real-Time PCR实验操作步骤

2.5 统计学处理

结果

1.免疫荧光染色和细胞培养结果

1.1 p-Ser473-Akt和pan-Akt在小鼠1-细胞胚 至4-细胞胚阶段中的分布

1.2 Akt 特异性抑制剂 API2 和 MK2206 对体外培养小鼠植入前胚发育的影响。

1.3 API-2和MK2206对体外发育2-细胞胚内p-Ser473-Akt和pan-Akt定位与表达的影响

2. Real-Time PCR结果

2.1 内参基因H2afz，四个ZGA标志基因和干细胞因子Oct4、Sox2的扩增和溶解曲线

2.2 API-2 对体外培养小鼠 2-细胞胚内 ZGA 标志基因的影响

2.3 API-2对体外培养小鼠2-细胞胚内干细胞因子Oct4和Sox2在mRNA表达水平的影响

讨论

结论

参考文献

综述：磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路与小鼠植入前胚

致谢