无创肢体缺血预处理延迟相中心肌差异表达蛋白质的分离和鉴定

摘要

【目的】
　　采用同位素相对标记与绝对定量（isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技术来研究无创肢体缺血预处理（Noninvasive Limb Ischemic Preconditioning，NLIP）延迟相阶段心肌全部蛋白质表达谱的变化，观察NLIP延迟相对正常大鼠心肌蛋白质表达的影响，探索NLIP内源性效应的分子机制。
　　【方法】
　　将12只雄性SD大鼠随机分入预处理组（NLIP组）和对照组（C组），每组6只。NLIP组用橡皮筋环扎大鼠右后肢根部，阻断血流5min，开放再灌注5min，共循环3次，建立NLIP模型； C组大鼠麻醉后不作预处理。于NLIP延迟相即24小时后，分别取两组大鼠左心室心尖部组织50-100mg，液氮保存。每组6个样本取等质量混合为一个起始材料进行蛋白抽提。采用iTRAQ技术经蛋白酶解、肽段标记、高PH反向分离、反向液相色谱串联质谱分析等步骤检测NLIP组和C组蛋白表达谱的差异。质谱分析数据用Mascot搜索引擎在Uniprot数据库进行肽段和蛋白质的鉴定。用Protein Pilot软件对报告离子峰强度值进行计算得出蛋白质的定量信息。以组间表达差异Ratio>1.2或Ratio<1/1.2（0.833）且统计学P-Value<0.05为标准筛选差异表达蛋白。利用基因本体论（Gene Ontology，GO）数据库分析差异表达蛋白的生物学功能，用Wolfpsort软件预测差异表达蛋白的亚细胞结构定位。最后用Western blot验证部分差异表达蛋白在两组样本中的表达水平。
　　【结果】
　　经iTRAQ检测和数据库搜索，共鉴定得到3280个蛋白质，其中55个蛋白质被认定为显著差异表达蛋白。NLIP组与C组相比，表达上调的蛋白有35个，表达下调的蛋白有20个。通过对差异表达蛋白的GO注释及亚细胞结构定位分析发现，这些蛋白主要存在细胞质、细胞核及线粒体中，广泛参与代谢、生物调节、应激反应及信号传导等过程，具有分子结合、催化、抗氧化及调节酶活性等功能。对差异表达蛋白ACOX1、PDK4和PRDX2的Western blot检测证实其蛋白表达趋势与iTRAQ相对定量结果基本一致，均在NLIP组中表达上调。
　　【结论】
　　NLIP延迟相中大鼠心肌蛋白质表达谱发生了改变，对差异表达蛋白质的功能分析提示NLIP的延迟相效应可能与这些蛋白质改善能量代谢、调节氧化应激水平、参与基因表达调控及蛋白质折叠与降解等过程有关。

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英文缩略语

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前言

材料与方法

1材料

2. 方法

结果

1．质量控制

2．蛋白鉴定结果

3．对显著差异表达蛋白的生物信息学分析

3. Western blot验证部分差异表达蛋白

讨论

1. NLIP模型的建立

2. iTRAQ技术在本研究中的应用价值

3. NLIP延迟相对正常大鼠心肌蛋白表达的影响及可能意义

4. 本实验的不足及展望

结论

参考文献

综述: 缺血再灌注损伤和缺血预处理对心肌蛋白质组的影响

致谢