建立瞬时转染细胞模型检测乙型肝炎病毒表型耐药

摘要

目的：
　　1、建立一种基于瞬时转染细胞模型的HBV表型耐药检测方法，并评价该方法的应用价值。
　　2、使用表型耐药检测技术对体外准种群进行耐药分析，探讨突变株比例不同的HBV准种群的耐药规律性。
　　方法：
　　1、建立基于瞬时转染细胞模型的HBV表型耐药检测方法
　　在入选CHB患者标本中筛选出含HBV野生株及突变株的血清标本各1例，并从中分离HBV DNA，使用全基因扩增技术在体外大量扩增HBV全基因组。利用BspQ I酶对真核表达载体pHY106以及包含HBV全基因组的pEASY-Blunt T载体进行酶切消化，并经连接、转化等步骤从单克隆菌落中筛选出正确连接HBV全基因组的转化子，构建重组真核表达载体pHY-CL与pHY-ZJ。大量提取重组质粒载体，并将上述两组质粒瞬时转染至HepG2细胞中，细胞培养后检测培养体系上清液中HBV DNA，以验证瞬时转染细胞模型的成功构建。以相同的转染方法分别转染两组质粒并在转染后的培养体系中，添加拉米夫定溶液使体系终浓度分别达到0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，测定在各种药物浓度下HBV DNA水平的改变并计算出IC50，以评价HBV野生株与突变株的药物敏感性。
　　2、HBV准种群的表型耐药检测与耐药规律性分析
　　使用定点突变方法诱导野生型重组质粒产生rtM204V点突变，将野生型质粒和经点突变的rtM204V突变型质粒混合，突变型质粒所占比例设定为0％、20%、40%、60%、80%、100%，以完成构成体外逆转录酶区准种群。不同比例组成的准种群分别转染至HepG2细胞中，检测在各种药物浓度下HBV DNA水平的改变，并计算出各准种群的IC50。探讨不同比例组成的HBV准种群在体外表型耐药的变化规律，评价表型耐药检测技术在HBV准种群耐药检测领域的应用价值。
　　结果：
　　1、成功建立了基于瞬时转染细胞模型的HBV表型耐药检测方法
　　在体外大量扩增HBV全基因组，并与真核表达载体pHY106相连接。结果表明成功构建了包含HBV野生株和突变株基因组的重组载体，且基因组序列与插入方向准确无误。将上述2种重组载体转染至HepG2细胞后在培养体系上清液中可检出高拷贝的HBV DNA，证实了瞬时转染细胞模型的成功构建。再次将野生型及突变型质粒转染至HepG2细胞中，在培养体系中添加不同浓度的LMV使得终浓度达到0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，检测相应药物浓度下HBV DNA水平，并计算IC50，结果显示野生型和突变型质粒的IC50分别为0.024μM与1.75μM，突变型质粒的IC50较野生型增加了73倍，在体外达到耐药水平。
　　2、HBV准种群的表型耐药检测
　　成功使用定点突变技术，对野生型重组质粒进行rtM204V点突变改造，结果能保证非RT区以外的剩余HBV基因组序列不发生任何改变。将突变型质粒比例为0%、20%、40%、60%、80%、100%的体外准种群转染至HepG2细胞中，IC50测定表明随着突变株在准种群内所占比例增大，IC50值亦显著增加，其中尤其以突变株占20%~40%的比例区间增加最为显著，该区间的细化分组试验亦能验证了这一结论，并提示HBV耐药性可在突变型比例达到25%~30%时形成。上述研究结果均揭示了HBV准种群中的野生株和突变株的比例组成与耐药发生相关，突变株比例增高可引发耐药，且准种群形成耐药的比例区间处于25%~30%的比例区间之内。
　　结论：
　　1、成功建立瞬时转染细胞模型介导的表型耐药检测方法，该方法可直观、准确地反映HBV的耐药情况以及其程度，可用于临床耐药的监测以及耐药规律性研究。
　　2、成功将表型耐药检测技术用于体外准种群的耐药分析，结果显示准种群内的比例组成与耐药发生密切相关，突变型所占比例达到25%~30%时可能导致耐药产生。

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缩略词表

中文摘要

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前言

1 HBV耐药的机制与检测

2 表型耐药检测的研究现状与其意义

第一部分建立基于瞬时转染细胞模型的HBV表型耐药检测方法

材料与方法

1 研究对象

2 主要试剂与仪器

3 方法

结果

1 HBV全基因组的扩增

2 HBV全基因组的TA克隆

3 含1.1倍HBV全基因组重组载体的构建

4 瞬时转染细胞模型的建立

5表型耐药检测

讨论

第二部分HBV突变株比例不同的准种群耐药规律性的研究

材料与方法

1 研究对象

2 主要试剂与仪器

3 方法

结果

1 rtM204V突变型重组质粒的定点突变

2 体外准种群的表型耐药检测

讨论

全文结论

参考文献

综述: 型肝炎病毒表型耐药检测技术的研究进展

致谢