TK-1和TIMP-1基因共表达抑制大鼠球囊拉伤后颈动脉内膜增生的实验研究

摘要

目的：
　　将介导人的TK-1和TIMP-1基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠颈总动脉球囊拉伤后血管内膜增生模型，观察并比较单基因（Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1）载体或双基因共表达载体（Ad-hTK-1-hTIMP-1）对拉伤后血管内膜增生的影响及可能机制。
　　方法：
　　应用经典的球囊拉伤法，建立SD大鼠左颈总动脉拉伤后血管内膜增生动物模型，取250-350g雄性SD大鼠随机分为6组：假手术组，单纯拉伤组，对照病毒组，Ad-hTK-1组，Ad-hTIMP-1组，双基因（Ad-hTK-1和Ad-hTIMP-1）组。除假手术组外，其余各组用2F球囊导管从颈外动脉进入颈总动脉并拉伤，分别在各组大鼠拉伤颈动脉处注射生理盐水（30μl）、对照病毒、Ad-hTK-1、Ad-hTIMP-1或双基因病毒(1×109pfu/只,在30μl病毒保存液里)。局部干预14天后处死大鼠，组织学检测内膜增生情况（计算内膜/中膜面积比），共聚焦免疫荧光检测 hTK-1、hTIMP-1基因的表达，蛋白免疫印迹法检测hTK-1、hTIMP-1、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平，免疫组化检测PCNA表达水平。
　　结果：
　　1.成功建立球囊拉伤大鼠颈总动脉的血管内膜增生动物模型（第一部分），球囊拉伤后7、14、28 d内膜面积（IA）和内膜/中膜面积比值（I/M）逐渐增大（趋势检验P＜0.01）；各实验组IA、I/M呈时间依赖性（7-28 d）增加（P＜0.01）。
　　2.与假手术组相比，单纯拉伤颈总动脉或对照病毒组大鼠的内膜面积（IA）和内膜/中膜面积比值(I/M)明显增加（P均＜0.01）。单纯拉伤组和对照病毒组间差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照病毒干预大鼠相比，Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1或双基因局部干预14d后，均可明显减少拉伤后大鼠颈总动脉IA（0.110±0.015比0.160±0.010；0.121±0.016比0.160±0.010；0.081±0.008比0.160±0.010；P均＜0.01）和I/M比值（1.443±0.097比2.035±0.117；1.522±0.078比2.035±0.117；0.972±0.072比2.035±0.117；均P＜0.01），明显抑制新生内膜增厚，抑制率分别为29.1％，25.2%和52.2%。与Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1单基因比较，双基因联合共表达可进一步降低IA和I/M比值（P均＜0.01），减轻内膜增生。
　　3.球囊拉伤后颈动脉损伤部位的PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显高于假手术组（均 P＜0.01）。单纯拉伤组与对照病毒组相比，PCNA、MMP-2和MMP-9水平均差异无统计学意义（均P＞0.05）。Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1或双基因干预后，均能显著下调PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平（均P＜0.01）。与Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1单基因比较，双基因联合共表达可进一步降低PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平（均P＜0.01）。
　　结论：
　　1.成功构建大鼠颈总动脉球囊拉伤后血管内膜增生模型，局部应用携带的目的基因 TK-1和（或）TIMP-1的重组腺病毒载体，可将目的基因成功转入颈总动脉，并获得有效表达。
　　2.TK-1或TIMP-1单基因过表达均可抑制球囊拉伤后内膜增生，与单基因（TK-1或TIMP-1）表达载体相比，同一载体介导的双基因（TK-1和TIMP-1）联合共表达抑制球囊拉伤后的大鼠颈动脉内膜增生具有叠加效应，可能的机制与下调PCNA、MMP-2和MMP-9的表达有关。
　　3.双基因共表达抑制颈动脉内膜增生效果优于单基因，为多基因治疗在临床前期治疗奠定实验基础。

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缩略词表

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前言

第一部分 大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生模型的构建

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要器械及仪器

1.4 实验方法

1.5 统计分析

2 结果

2.1 大鼠存活情况

2.2 血管形态学改变

2.3 血管形态学参数测定

3 讨论

第二部分 TK-1和TIMP-1共表达对球囊拉伤大鼠颈动脉内膜增生的影响

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要器械及仪器

1.4 主要试剂的配制

1.5 实验方法

1.6 统计分析

2 结果

2.1荧光显微镜下观察动脉损伤段绿色荧光蛋白表达

2.2 共聚焦显微镜和蛋白免疫印迹法，观察两目的蛋白（hTK-1和hTIMP-1）是否成功共表达

2.3 hTK-1和hTIMP-1基因转移对球囊拉伤大鼠颈动脉内膜增生的影响

2.4基因转移对球囊拉伤大鼠颈动脉 MMP-2和MMP-9表达的影响

2.5 免疫组织化学检测PCNA阳性细胞在颈动脉内膜中膜的表达

3 讨论

全文结论

参考文献

文献综述: 组织激肽释放酶与基质金属蛋白酶在血管损伤后再狭窄中研究进展

致谢