ERα特异性抑制剂MPP对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡相关因子Nanog、CyclinD1、CyclinE表达的影响

摘要

目的: 1.研究胚胎干细胞转录因子Nanog蛋白在昆明（kunming，KM）小鼠植入前胚不同发育阶段的定位表达情况； 2.研究雌激素受体α（estrogen receptorα,ERα）特异性抑制剂MPP（20μM）对小鼠2-细胞胚Nanog蛋白定位的影响； 3.研究MPP处理对细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E定位的影响； 4.研究MPP处理对Nanog和Cyclin D1、Cyclin E mRNA表达情况的影响； 阐明ERα对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡的作用，为进一步探讨ERα在小鼠植入前胚大规模合子基因组激活中的作用机制提供理论依据。 方法: 1.分别获取KM小鼠GV卵、MⅡ卵和hCG注射后21h、27h的1-细胞胚，以及hCG注射后33h、39h、45h、51h的2-细胞胚（其中33h组含有部分1-细胞胚，51h组含部分3-细胞胚和4-细胞胚）。采用细胞免疫荧光技术，检测Nanog蛋白在小鼠植入前胚不同发育阶段的定位分布情况。 2.收集KM小鼠1-细胞胚（hCG后27h），分别置于KSOM培养液（对照组）及添加有20μM MPP的培养液（实验组）中进行体外培养，获取发育至2-细胞阶段（hCG后45h）的植入前胚，利用细胞免疫荧光技术，检测两组细胞Nanog蛋白的定位表达情况。 3.收集KM小鼠1-细胞胚（hCG后27h），分别置于KSOM培养液及添加有20μM MPP的培养液中进行体外培养，获取发育至2-细胞阶段（hCG后45h、48h）的植入前胚，利用细胞免疫荧光技术，检测两组细胞CyclinD1和Cyclin E蛋白的定位表达情况。 4.收集KM小鼠1-细胞胚（hCG后27h），分别置于KSOM培养液及添加有20μM MPP的培养液中进行体外培养，获取发育至2-细胞阶段（hCG后45h）的植入前胚，利用Real Time-PCR技术，检测两组细胞Nanog与Cyclin D1、Cyclin E的mRNA表达水平。 结果: 1.细胞免疫荧光染色结果显示，在小鼠GV卵、MII卵和hCG注射后21h、27h以及33h的1-细胞胚中均未观察到Nanog表达；而hCG注射后33h、39h、45h和51h的2-细胞胚中可见Nanog表达；而且Nanog在2-细胞胚中的表达水平于hCG后39h最高，在hCG后45h、51h，表达水平下降；另外，于hCG后51h收集的3-细胞胚和4-细胞胚中的Nanog蛋白表达水平极低。 2.经27-45h MPP（20μM）处理后，小鼠2-细胞胚内Nanog总体荧光强度较KSOM组明显减弱（P<0.01），且细胞核内的Nanog荧光强度与KSOM组比较，也明显下降（P<0.01）。 3.经27-45hMPP（20μM）处理后，2-细胞胚内Cyclin D1总体荧光强度较KSOM组明显下降（P<0.01）；细胞核内CyclinD1荧光强度较KSOM组明显减弱，差异具有统计学意义（P<0.05）。经27-48h MPP（20μM）处理后，2-细胞胚内Cyclin E总体荧光强度较KSOM组明显减弱（P<0.01）；2-细胞胚核内的Cyclin E荧光强度也明显下降（P<0.01）。 4.Real Time-PCR结果显示：与KSOM对照组比较，MPP（20μM）组2-细胞胚内Nanog、Cyclin D1mRNA表达水平无明显改变，差异不具有统计学意义（P>0.05）；而Cyclin EmRNA表达水平明显下调（P<0.01）。 结论: Nanog蛋白在小鼠植入前胚早期阶段性高表达于hCG后39h，提示Nanog可能参与小鼠2-细胞胚G1/S期过渡，以及参与调控大规模合子基因组激活。经MPP（20μM）处理后，Nanog蛋白以及G1/S期过渡相关蛋白Cyclin D1和Cyclin E在2-细胞胚中表达量较KSOM组明显下调；另外较KSOM组Nanog、Cyclin D1的mRNA表达水平不受影响，而CyclinE mRNA水平较KSOM组明显下调，提示ERα可能调控Nanog、Cyclin D1转录后蛋白翻译水平，而对Cyclin E在转录与蛋白翻译水平均有影响。

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引言

材料与方法

1材料

1.1 实验动物

1.2 主要实验仪器、耗材和试剂

1.3 试剂配制

2 方法

2.1 超排卵和受精

2.2 卵母细胞和植入前胚的收集

2.3 1-细胞胚的收集和体外培养

2.4 免疫荧光技术实验步骤

2.5Real Time-PCR实验操作步骤

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 Nanog蛋白定位分布检测实验结果

3.2 ERα特异性抑制剂MPP处理对小鼠2-细胞胚Nanog蛋白表达的影响

3.3ERα特异性抑制剂MPP处理对CyclinD1和Cyclin E蛋白表达的影响

3.4Real-Time PCR检测结果

讨论

结论

参考文献

综述:microRNAs在植入前胚发育关键时期中的作用

致谢