白介素10对紫外线诱导的肝细胞凋亡小体活化大鼠原代星状细胞的影响

摘要

背景：肝纤维化是各种慢性肝病发展成肝硬化的必经阶段，现研究表明，肝纤维化有逆转的可能。深入研究肝纤维化发病机制，对控制肝硬化的发生和发展具有重要意义。肝纤维化形成过程中，肝星状细胞的活化处于中心环节，近年来研究发现，肝细胞凋亡与肝星状细胞活化有密切关系。IL-10被证实在肝脏损伤时有抗炎和抗肝纤维化作用，探索IL-10对因凋亡细胞刺激而激活的星状细胞的可能影响及作用机制，将为IL-10临床干预和治疗肝纤维化提供理论依据。 目的：在体外以紫外线诱导肝细胞凋亡，将凋亡小体和大鼠原代星状细胞共培养，观察星状细胞形态学和功能学的变化；以IL-10干预共培养过程，观察IL-10对星状细胞自身活化和凋亡小体刺激活化的不同影响，阐述IL-10在HSC活化过程中的作用。 方法：用原位分离和离体循环灌注法分离大鼠肝星状细胞，得到5.0×107的细胞数，进行细胞活力和纯度的检测。油红0染色观察星状细胞的储脂能力。原代星状细胞2.0×105/孔接种于6孔板，加入20%FBS的DMEM培养基2ml绝对静置48h后，进行分组实验：1.以含不同浓度IL-10（2、10、20ng/ml）、高糖 DMEM培养原代HSC24、48、72、96h后，采用QRT-PCR法检测不同浓度不同时间IL-10干预对HSCs中α-SMA、TGF-β1和I型胶原蛋白（Col I）mRNA的基因表达的影响，确定IL-10抑制HSCs活化的最佳浓度为20ng/ml；2.以紫外线诱导肝细胞发生凋亡，将凋亡小体和原代 HSCs共培养24、48、72、96h，并用IL-10（20ng/ml）对共培养进行干预，采用QRT-PCR法检测HSCs中α-SMA、TGF-β1和Col I的mRNA基因表达量，观察凋亡小体对原代HSCs活化的影响，及IL-10对由凋亡小体刺激活化的HSCs功能的影响。 结果： 1.分离原代HSCs，最终得到的HSCs数可达5.0×107，HSCs纯度和活力分别为91%和98%左右。 2.不同浓度IL-10（2、10、20ng/ml）、高糖 DMEM培养原代HSCs24、48、72、96h后，QRT-PCR法检测HSCs中α-SMA、TGF-β1和Col I的mRNA表达，与空白组比较，不同浓度IL-10组三者表达均下调（p<0.05），其中IL-10（20ng/ml）组较空白对照组变化最为显著。 3.以紫外线诱导肝细胞凋亡，培养48h后死亡细胞可达79%，凋亡细胞可达21%。以凋亡小体和HSCs共培养24、48、72、96h，QRT-PCR法检测HSCs中α-SMA、TGF-β1和ColIm的RNA表达，三者表达在共培养组较空白对照组明显上调（p<0.05），且随着时间延长效应增加。 4.IL-10（20ng/ml）、凋亡小体和HSCs共培养24、48、72、96h后，QRT-PCR法检测HSCs中α-SMA、TGF-β1和ColI mRNA的表达，三者在IL-10组较凋亡小体组明显下调（p<0.05）。 结论： 1.成功高效分离大鼠原代HSCs。 2.IL-10可抑制原代HSCs的自发活化。 3.紫外线诱导的肝细胞凋亡小体可刺激HSCs的活化，且随着时间的延长刺激效应增强。 4.IL-10对凋亡小体刺激引起的HSCs活化有抑制作用。

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前言

第一部分 大鼠原代HSCs的分离

1.1 材料

1.2 方法

1.3实验结果

1.4讨论

1.5结论

第二部分 IL-10对紫外线诱导的肝细胞凋亡小体活化原代星状细胞的影响

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 实验分组

2.4 实验方法

2.5 统计学处理

2.6 试验结果

2.7讨论

2.8结论

参考文献

综述: 肝细胞凋亡与肝纤维化

致谢