一种大鼠静止态胰腺星状细胞的提取方法

摘要

本发明公开一种大鼠静止态胰腺星状细胞的提取方法，包括以下步骤：S1、配制DMEM/F12培养基；S2、将大鼠胰腺充分剪碎；S3、将胰腺组织块涂布在细胞培养皿底部培养1‑3h；S4、加入DMEM/F12培养基培养24‑48h；S5、除去培养基，使用PBS润洗一遍后除去PBS，加入胰蛋白酶浸润后除去胰蛋白酶；S6、孵育80‑120s，加入DMEM/F12培养基终止消化，轻柔吹打3‑5次，将静止态胰腺星状细胞吹打悬浮；S7、将步骤S6的细胞悬浮液过滤收集滤液，即得到大鼠静止态胰腺星状细胞。本发明方法步骤简单、易于操作、节省时间；获得的静止态胰腺星状细胞产率高且纯度高，同时其整个过程中仅用到一种价格较为低廉的胰蛋白酶，成本与密度梯度离心法相比大大降低。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体的是一种大鼠静止态胰腺星状细胞的提取方法。

背景技术

静止态的胰腺星状细胞具有干细胞性质但含量极少，具有重要的科研价值和临床转化价值。现有提取方法是密度梯度离心法，即采用碘海醇作为离心介质，配制两种不同密度的溶液，利用静止态胰腺星状细胞密度稍小的原理，通过密度梯度离心获得该细胞。但该方法具有明显的问题，首先其操作复杂难以掌握，需要采用三种酶配成的混合液将胰腺消化成单细胞，消化时间长了细胞易死亡，消化时间短了无法得到单细胞进行离心；其次，由于静止态胰腺星状细胞并不比其它细胞轻很多，采用密度梯度离心法得到的细胞产率低且混有其它细胞类型；第三，上述方法所使用的三种酶和细胞级别碘海醇的价格都较为昂贵。

发明内容

为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供一种大鼠静止态胰腺星状细胞的提取方法，采用该方法提取静止态胰腺星状细胞可实现操作简单、产率高、成本低廉的目标。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种大鼠静止态胰腺星状细胞的提取方法，包括以下步骤：

S1、配制含有胎牛血清和青链霉素的DMEM/F12培养基；

S2、采用手术方法得到新鲜的大鼠胰腺，使用步骤S1的DMEM/F12培养基将胰腺冲洗2-4遍，再将大鼠胰腺充分剪碎；

S3、将胰腺组织块涂布在细胞培养皿底部，将涂布好的培养皿底朝上倒扣在培养箱中培养1-3h；

S4、取出培养皿，向培养皿中加入步骤S1的DMEM/F12培养基，放回培养箱中培养24-48h；

S5、除去培养基，使用PBS润洗一遍后除去PBS，向培养皿加入胰蛋白酶，浸润组织块后立刻除去胰蛋白酶；

S6、将培养皿放入培养箱中孵育80-120s，向培养皿中加入步骤S1的DMEM/F12培养基终止消化，轻柔吹打3-5次，将静止态胰腺星状细胞吹打悬浮；

S7、将步骤S6的细胞悬浮液过筛网，除去残留的组织块，收集滤液，即得到大鼠静止态胰腺星状细胞。

进一步优选地，步骤S1中胎牛血清占DMEM/F12培养基总质量的10-20％，青链霉素占DMEM/F12培养基总质量的0.5-2％。

进一步优选地，步骤S2中大鼠胰腺剪碎后胰腺组织块的直径小于0.5mm。

进一步优选地，步骤S3中每个培养皿涂布30-40个组织块。

进一步优选地，培养箱温度为37℃。

进一步优选地，步骤S7中细胞悬浮液过70-90目筛网。

本发明的有益效果：

本发明方法步骤简单、易于操作、节省时间，获得的静止态胰腺星状细胞产率高(每0.1g大鼠胰腺可获得3.0-4.5×10

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明实施例1组织块周围的静止态胰腺星状电子显微镜照片；

图2是本发明实施例1提取的大鼠静止态胰腺星状细胞电子显微镜照片；

图3是本发明实施例2组织块周围的静止态胰腺星状电子显微镜照片；

图4是本发明实施例2提取的大鼠静止态胰腺星状细胞电子显微镜照片；

图5是本发明实施例2组织块周围的静止态胰腺星状电子显微镜照片；

图6是本发明实施例3提取的大鼠静止态胰腺星状细胞电子显微镜照片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种大鼠静止态胰腺星状细胞的提取方法，包括以下步骤:

S1、配制含有20％胎牛血清(Gibco公司)和0.5％青链霉素的DMEM/F12(Gibco公司)培养基(以下简称培养基)；

S2、灭菌手术器械，采用手术方法得到新鲜的大鼠胰腺，使用培养基将胰腺冲洗3遍，使用眼科手术剪将胰腺充分剪碎，剪碎后的胰腺组织块的直径小于0.5mm；

S3、将胰腺组织块涂布在6cm细胞培养皿底部，每个培养皿涂布30-40个组织块，将培养皿底朝上倒扣在37℃培养箱中培养2h。

S4、2小时后取出培养皿，向每个培养皿中加入3mL培养基，放回37℃培养箱中培养24h；

S5、24h后取出培养皿，观察组织块周围已有静止态胰腺星状细胞，如图1所示。弃培养基，使用1mL PBS(生工生物公司)润洗一遍，弃PBS，每个培养皿加入300μL胰蛋白酶(Gibco公司)，浸润组织块后立刻吸弃胰蛋白酶；

S6、放入37℃培养箱中孵育115秒，向培养皿中加入600μL培养基终止消化，轻柔吹打3次，可将静止态胰腺星状细胞吹打悬浮

S7、将上述培养基过90目筛网，除去残留的组织块，静止态胰腺星状细胞可以滤过，收集上述滤液，即得到大鼠静止态胰腺星状细胞，其电子显微镜照片如图2所示。

通过计算得到的胰腺星状细胞的产量为每0.1g大鼠胰腺可获得4.5×10

实施例2

一种大鼠静止态胰腺星状细胞的提取方法，包括以下步骤:

S1、配制含有15％胎牛血清(Gibco公司)和1％青链霉素的DMEM/F12(Gibco公司)培养基(以下简称培养基)；

S2、灭菌手术器械，采用手术方法得到新鲜的大鼠胰腺，使用培养基将胰腺冲洗3遍，使用眼科手术剪将胰腺充分剪碎，剪碎后的胰腺组织块的直径小于0.5mm；

S3、将胰腺组织块涂布在6cm细胞培养皿底部，每个培养皿涂布30-40个组织块，将培养皿底朝上倒扣在37℃培养箱中培养2小时。

S4、2小时后取出培养皿，向每个培养皿中加入3mL培养基，放回37℃培养箱中培养36小时；

S5、36小时后取出培养皿，观察组织块周围已有静止态胰腺星状细胞，如图3所示。弃培养基，使用1mL PBS(生工生物公司)润洗一遍，弃PBS，每个培养皿加入250μL胰蛋白酶(Gibco公司)，浸润组织块后立刻吸弃胰蛋白酶；

S6、放入37℃培养箱中孵育100秒，向培养皿中加入500μL培养基终止消化，轻柔吹打5次，可将静止态胰腺星状细胞吹打悬浮

S7、将上述培养基过80目筛网，除去残留的组织块，静止态胰腺星状细胞可以滤过，收集上述滤液，即得到大鼠静止态胰腺星状细胞，其电子显微镜照片如图4所示。

通过计算得到的胰腺星状细胞的产量为每0.1g大鼠胰腺可获得3.7×10

实施例3

一种大鼠静止态胰腺星状细胞的提取方法，包括以下步骤:

S1、配制含有20％胎牛血清(Gibco公司)和2％青链霉素的DMEM/F12(Gibco公司)培养基(以下简称培养基)；

S2、灭菌手术器械，采用手术方法得到新鲜的大鼠胰腺，使用培养基将胰腺冲洗3遍，使用眼科手术剪将胰腺充分剪碎，剪碎后的胰腺组织块的直径小于0.5mm；

S3、将胰腺组织块涂布在6cm细胞培养皿底部，每个培养皿涂布30-40个组织块，将培养皿底朝上倒扣在37℃培养箱中培养2小时。

S4、2小时后取出培养皿，向每个培养皿中加入3mL培养基，放回37℃培养箱中培养36小时；

S5、36小时后取出培养皿，观察组织块周围已有静止态胰腺星状细胞，如图5所示。弃培养基，使用1mL PBS(生工生物公司)润洗一遍，弃PBS，每个培养皿加入200μL胰蛋白酶(Gibco公司)，浸润组织块后立刻吸弃胰蛋白酶；

S6、放入37℃培养箱中孵育90秒，向培养皿中加入400μL培养基终止消化，轻柔吹打5次，可将静止态胰腺星状细胞吹打悬浮

S7、将上述培养基过70目筛网，除去残留的组织块，静止态胰腺星状细胞可以滤过，收集上述滤液，即得到大鼠静止态胰腺星状细胞，其电子显微镜照片如图6所示。

通过计算得到的胰腺星状细胞的产量为每0.1g大鼠胰腺可获得3.9×10

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。