GLP-1类似物Liraglutide改善MG诱导的小鼠认知功能损伤及机制初探

摘要

目的：糖尿病是引起老年人认知功能下降的高危因素，本文旨在探讨糖代谢产物甲基乙二醛（Methylglyoxal, MG）侧脑室注射给药对C57BL/6J小鼠认知功能及脑组织tau蛋白磷酸化程度的影响；观察新型降糖药GLP-1类似物Liraglutide对MG诱导的小鼠认知功能损伤的改善作用，初步探讨其可能的作用机制。在体外部分，通过观察Liraglutide对MG诱导的人神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y）损伤的改善作用，结合相关通路的抑制剂，进一步验证Liraglutide调节MG诱导的神经细胞tau蛋白磷酸化的作用及其机制。
　　方法：⑴探讨侧脑室注射MG对小鼠认知功能的影响。SPF级8周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分为溶媒对照生理盐水（Normal saline, NS）组、MG低剂量组、MG中剂量组、MG高剂量组、阳性对照β淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)组，各亚组10只，分别单次侧脑室注射等体积0.35μmol MG、0.7μmol MG、1.4μmol MG或410 pmol寡聚体Aβ1-42诱导认知功能障碍，对照组侧脑室注射等体积生理盐水。8周后应用 Morris水迷宫观察不同剂量的 MG对小鼠认知能力损伤情况，同时Western-blot检测tau蛋白磷酸化程度及其对相关的调控信号通路Akt/GSK-3β的影响。⑵探讨皮下注射Liraglutide对MG侧脑室注射诱导小鼠认知功能损伤的改善作用，并对机制做初步探讨。SPF级8周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分为溶媒对照Control组、Liraglutide组、MG组、MG+Liraglutide组、模型阳性对照 Aβ组及Aβ+Liraglutide组，每个亚组13-15只。MG组、MG+Liraglutide组采用侧脑室注射0.7μmol MG，Aβ组及Aβ+Liraglutide组采用侧脑室注射410 pmol寡聚体Aβ1-42。应用Y迷宫、Morris水迷宫等行为学方法观察皮下注射Liraglutide（25nmol/kg/day）8周对小鼠学习和记忆的改善情况，利用透射电镜观察小鼠海马 CA1区锥体细胞及突触的超微结构，通过检测小鼠大脑皮层超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidas, GSH-PX）活力及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量观察小鼠脑组织氧化应激情况，免疫组织化学检测小鼠脑组织皮层 p-tau(Ser396)的表达， Westernblot检测海马 p-tau(Ser202)及p-tau(Ser396)的表达及调控通路Akt/GSK-3β的活化程度。⑶结合PI3K/Akt/GSK-3β信号通路中PI3K的抑制剂Wortmannin，观察Liragltuide对MG诱导SH-SY5Y神经细胞tau蛋白的过度磷酸化的影响及其可能的机制。该部分予以不同浓度的Liraglutide（0,10,100,200 nM）预处理SH-SY5Y神经细胞24小时，之后用不同浓度的MG（0,250,500,750μmol/L）诱导细胞12h，通过CCK8实验检测细胞的存活率及凋亡率选取合适的作用浓度。实验分为溶媒对照组、Liraglutide组、MG组、MG+Liraglutide组、MG+Liraglutide+Wortmannin组和MG+GLP-1组。Western-blot检测不同组的p-tau(Ser202)及p-tau(Ser396)表达水平，对调节tau蛋白信号通路的关键信号分子Akt、GSK-3β磷酸化水平分别进行检测。进一步应用 PI3K抑制剂 Wortmannin进行干预，以确认 Liraglutide是否通过Akt/GSK-3β信号通路影响tau蛋白的磷酸化水平。
　　结果：①不同剂量的MG侧脑室注射后能损伤小鼠的认知功能，但各剂量间无显著差别，因此在后续的实验中选择侧脑室注射中等剂量的 MG（0.7μmol）侧脑室注射以诱导认知功能损伤模型；而侧脑室注射0.7μmol的 MG可能可以通过Akt/GSK-3β信号通路促进小鼠脑组织tau蛋白的磷酸化；②行为学实验提示：持续皮下注射Liraglutide（25nmol/kg/day）8周对MG侧脑室注射诱导的小鼠认知功能损伤可能具有改善作用。并且，透射电镜提示Liraglutide能够减少MG诱导的认知功能损伤小鼠海马CA1区锥体细胞及突触的结构退化。③皮下注射Liragltide具有改善氧化应激的作用，能够降低MG诱导的认知功能损伤小鼠脑组织中的丙二醛（MDA）的含量，可以提高超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性，从而减少神经元细胞内脂褐素累积和线粒体结构的损伤，可能具有提高机体抗氧化能力并延缓神经细胞退行性改变。并且，可能通过调节海马区Akt/GSK-3β信号通路，降低p-tau(Ser202)及p-tau(Ser396)的表达。对Aβ组进行干预，也得到类似的结果。④体外实验表明：Liraglutide预处理SH-SY5Y神经细胞能明显提高MG对其损伤的存活率。Western-blot结果显示，Liraglutide能降低MG诱导的神经细胞中p-tau(Ser202)及p-tau(Ser396)的表达。在给予PI3K抑制剂Wortmannin之后，Akt和GSK-3β磷酸化程度明显降低，而p-tau(Ser202)及p-tau(Ser396)的表达明显升高。提示Liraglutide可能通过调节Akt/GSK-3β信号通路影响tau蛋白的过度磷酸化水平。
　　结论：MG可能通过Akt/GSK-3β信号通路诱导tau蛋白磷酸化从而损害认知功能；Liraglutide干预后能通过改善抗氧化应激，减少神经元细胞的氧化损伤，调节Akt/GSK-3β信号通路降低磷酸化 tau蛋白的表达，从而改善认知功能。此外， Liraglutide对阳性对照药 Aβ引起的小鼠认知功能损伤也具有改善作用。因此， GLP-1类似物Liraglutide可能具有改善认知功能，促进神经退行性病变的恢复的作用。

目录

声明

英文缩略词表（Abbreviations and acronyms）

前言

第一部分 Liraglutide改善MG侧脑室注射诱导的小鼠认知功能损伤

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分 Liraglutide影响MG诱导的神经细胞tau蛋白磷酸化的机制初探

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

总结

参考文献

课题综述：GLP-1: 治疗2型糖尿病相关的阿尔茨海默病的新策略

致谢