雷公藤氯内酯醇通过PI3K信号通路诱导肺癌细胞的自噬并增加A549/DDP对顺铂的敏感性

摘要

【目的】：
　　肺癌是目前世界上死亡率最高的疾病之一，研究新型的药物对肺癌的治疗起关键作用。雷公藤氯内酯醇是从雷公藤中提取出来的一种药物，具有更低的毒性，已有研究发现，雷公藤氯内酯醇可诱导肺癌细胞的自噬，但其发生机制尚未阐明。在本研究中，我们探讨了雷公藤氯内酯醇通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导肺癌细胞的自噬，并且首次发现了雷公藤氯内酯醇可增加 A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。本研究旨在明确T4在肺癌治疗中所可能扮演的角色以及发挥作用的下游机制。
　　【方法】：
　　1. A549肺腺癌细胞用高糖DMEM+10%胎牛血清培养于培养瓶中，A549/DDP顺铂耐药的肺腺癌细胞用1640+10%胎牛血清培养于培养瓶中。先用CCK8实验来测定雷公藤氯内酯醇的最佳作用浓度，然后用最佳作用浓度的雷公藤氯内酯醇去干预细胞，提取总蛋白观察LC3(自噬特异性蛋白)的变化，PI3K/Akt/mTOR信号通路的蛋白变化及其磷酸化水平的变化。
　　2.将细胞消化接种于6孔板后，先用wortmannin（PI3K抑制剂）, perifosine（Akt抑制剂）或 rapamycin（mTOR抑制剂）预处理1h后，再加入最佳作用浓度的雷公藤氯内酯醇去干预细胞，提取总蛋白观察 LC3(自噬特异性蛋白)的变化， PI3K/Akt/mTOR信号通路的蛋白变化及其磷酸化水平的变化。
　　3.将细胞消化接种于96孔板后，加入最佳作用浓度的雷公藤氯内酯醇后，通过CCK8来检测PI3K及AKT的活性。
　　4.将细胞消化接种于6孔板后，用过表达的AKT质粒去干预细胞，24小时后提取细胞总蛋白，观察LC3的表达变化。
　　5.将细胞消化接种于6孔或96孔后，用CCK8,qPCR和WB等方法检测雷公藤氯内酯醇作用后的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。
　　【结果】：
　　1.用CCK8实验来测定雷公藤氯内酯醇（T4）对A549和A549/DDP的最佳作用浓度为200nM，24h。WB显示PI3-K, PI3-P, Akt, TSC2, mTOR, p70S6K和4E-BP1的蛋白表达水平没有明显变化，但其对应的磷酸化水平有下降。
　　2.当抑制剂和雷公藤氯内酯醇（T4）共同作用的时候，WB结果显示 LC3明显表达增强，而在对照组和实验组中，PI3-K, PI3-P, Akt, TSC2, mTOR, p70S6K and4E-BP1的表达都没有变化，但他们的磷酸化水平均有一定的变化。
　　3.雷公藤氯内酯醇（T4）可以降低A549和A549/DDP细胞中PI3K及AKT的活性。
　　4.雷公藤氯内酯醇（T4）作用肺腺癌细胞后，LC3的表达水平增强，而过表达的AKT质粒可使T4的作用减弱。
　　5.雷公藤氯内酯醇（T4）作用 A549/DDP细胞后，CCK8显示顺铂对细胞的致死作用明显增强，qPCR和WB都显示MDR1的表达水平明显下降。
　　【结论】：
　　1.雷公藤氯内酯醇可以通过自噬的方式诱导肺癌细胞的死亡。
　　2.雷公藤氯内酯醇通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导肺癌细胞的自噬。
　　3.雷公藤氯内酯醇能有效的增加A549/DDP对顺铂的敏感性。

目录

声明

附录一英文缩略词表

附录二试剂配方

附录三主要仪器设备

前言

第一章 T4可诱导肺腺癌细胞死亡，并增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性

1.1引 言

1.2材料与方法

1.3结 果

1.4讨 论

1.5小 结

第二章 雷公藤氯内酯醇（T4）可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肺癌细胞的自噬

2.1引 言

2.2材料与方法

2.3结 果

2.4讨 论

2.5小 结

结论

参考文献

综述:雷公藤氯内酯醇诱导肺癌细胞自噬的机制及与耐药相关的研究进展

致谢