慢病毒介导mCherry红色荧光蛋白标记的前列腺癌PC-3细胞外泌体构建、鉴定及对细胞缝隙连接的影响

摘要

目的与意义：
　　外泌体是由人体多种类型细胞产生分泌的小囊泡状结构（30~100nm），能稳定存在于人体各种体液中，包括：尿液、血浆、唾液及乳液等。外泌体表面和内部携带各种物质（蛋白质、miRNA、lncRNA等）。肿瘤细胞分泌的外泌体可以影响肿瘤微环境，降低细胞间缝隙通讯，促进前列腺癌细胞侵袭和转移能力提升，增加癌细胞恶性程度。在本研究中，我们拟构建出mCherry红色荧光蛋白标记的前列腺癌PC-3细胞外泌体，基于红色荧光蛋白具有体内外示踪特点，因此本研究构建的细胞株可以为后续对前列腺癌微环境中外泌体研究提供有力的生物标志物，为前列腺癌微环境间信号通讯研究提供有力的基础工具。
　　方法与材料：
　　人前列腺癌PC-3细胞体外培养。通过化学方法合成目的基因cDNA。利用PCR技术合成mCherry+CD63。将合成的目的基因与线性载体连接，转化细菌感受态细胞。通过目的基因PCR电泳、重组质粒双酶切产物电泳以及基因测序，验证重组质粒构建成功；通过慢病毒介导方式将mCherry+CD63（人）重组质粒稳定转染前列腺癌PC-3细胞，得到PC3-mCherry细胞株。通过旋转超级过滤分离法提取细胞上清液中外泌体，Western-blot法检测外泌体表面特征性蛋白CD63表达，荧光倒置显微镜下观察PC3-mCherry细胞株及其分泌的外泌体形态结构。不同浓度外泌体处理前列腺癌PC-3细胞后，western-blot法检测α-SMA、Vimentin、E-cadherin和CX43蛋白表达水平。
　　结果：
　　1、人前列腺癌PC-3细胞体外常规培养：贴壁生长，为长梭形、多角形或不规则形。
　　2、重组质粒LV6-mCherry+CD63（人）构建成功。
　　3、PC3-mCherry细胞株成功构建，并且能够分泌出带有mCherry红色荧光蛋白标记的外泌体。
　　4、外泌体能上调Vimentin和α-SMA蛋白表达，同时下调E-cadherin和CX43蛋白表达。
　　结论：
　　1、成功构建了携带mCherry红色荧光蛋白的LV6-mCherry+CD63（人）重组质粒。
　　2、mCherry红色荧光蛋白成功地标记人前列腺癌PC-3细胞，得到PC3-mCherry细胞株。
　　3、成功分离PC3-mCherry细胞分泌的外泌体，并且在荧光倒置显微镜下外泌体可以发出强烈的红色荧光，为后续的外泌体的研究提供有力的工具。
　　4、前列腺癌PC-3细胞分泌外泌体能降低前列腺癌PC-3细胞间CX43表达，使细胞间缝隙连接通讯降低或丢失，同时可以上调Vimentin和α-SMA蛋白表达及下调E-cadherin，促进肿瘤细胞EMT。最终促进肿瘤细胞侵袭和转移。

目录

声明

缩略词表

前言

材料与方法

1、实验材料与仪器

2、实验试剂配制

3、实验方法：

结果

1. 人前列腺癌PC-3细胞的常规培养。

2. 重组质粒LV6-mCherry+CD63（人）鉴定结果。

3. mCherry红色荧光蛋白标记的前列腺癌PC-3细胞鉴定。

4. mCherry红色荧光蛋白标记的外泌体提取与鉴定结果。

5. 前列腺癌PC-3细胞经过不同浓度外泌体处理后相关蛋白表达情况。

6. 外泌体对前列腺癌PC-3细胞侵袭性的影响。

讨论

结论

参考文献

综述：外泌体在肿瘤诊断上新进展

致谢