Raptor介导小豆蔻明抑制氨基酸激活mTORC1的研究

摘要

目的：
　　1.明确Raptor（regulatory associated protein of mTOR）在氨基酸信号调控mTORC1（mammalian target of rapamycin complex1）活性中的作用；
　　2.探讨小豆蔻明（cardamonin，CAR）抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖是否与抑制氨基酸介导的mTORC1活化有关。
　　方法：
　　1.shRNA干扰SKOV3细胞Raptor蛋白表达
　　构建的Raptor-shRNA慢病毒表达载体，感染人卵巢癌SKOV3细胞，经嘌呤霉素筛选感染细胞，Western Blot鉴定Raptor干扰效果。
　　2.细胞培养
　　人卵巢癌 SKOV3细胞以及 Lv-Raptor-shRNA感染 SKOV3细胞常规培养（37℃、5%CO2）在加入10%胎牛血清、100μg·mL-1链霉素及100 U·mL-1青霉素的 High-glucose DMEM培养液中，保持细胞单层贴壁生长，待细胞长至80%～90%融合时，加入适量0.25%胰蛋白酶消化传代。
　　3.分组
　　3.1.SKOV3细胞分为空白组[NC（Normal condition）组]、CAR组（Cardamonin：10、30μM）、阳性对照药雷帕霉素组（Rapamycin，RAP：0.1μM）及 AZD组（AZD8055：0.1μM）。检测mTORC1相关蛋白表达；
　　3.2.SKOV3细胞[检测mTOR和LAMP2（lysosomeassociated membrane protein）共定位、mTORC1活性及细胞增殖]和Lv-Raptor-shRNA感染SKOV3细胞（检测细胞增殖）分别设立NC组、CAR组（10、30μM）、氨基酸饥饿组（-AA，150 min）、氨基酸刺激组（+AA，150 min），以及氨基酸刺激的同时分别加入RAP（0.1μM）、AZD（0.1μM）和CAR（10、30μM）组；
　　3.3.SKOV3细胞和Lv-Raptor-shRNA感染SKOV3细胞分别设立NC组、氨基酸饥饿组（-AA，150 min）、氨基酸刺激组（+AA，150 min）、氨基酸刺激同时加入CAR（30μM）组。测定mTOR和LAMP2共定位以及mTORC1信号通路活性。
　　4.测定指标及方法
　　4.1.倒置显微镜观察细胞的形态及生长状况；
　　4.2.荧光显微镜观察慢病毒感染SKOV3细胞效率；
　　4.3.MTT法检测细胞增殖；
　　4.4.激光共聚焦显微镜观察mTOR和LAMP2共定位；
　　4.5.Western Blot法检测mTOR、p-mTOR、Raptor、4E-BP1、p-4E-BP1、S6K1、p-S6K1蛋白表达。
　　结果：
　　1.CAR显著抑制氨基酸诱导的SKOV3细胞增殖（P＜0.01）。
　　2.CAR显著抑制SKOV3细胞的mTOR、S6K1蛋白磷酸化，同时抑制Raptor总蛋白表达（P＜0.05）。
　　3.重组慢病毒表达载体测序无误；Lv-Raptor-shRNA组和阴性对照组SKOV3细胞经嘌呤霉素加药筛选后，其荧光表达率均在95%以上，且Lv-Raptor-shRNA组SKOV3细胞Raptor表达显著低于正常对照组和阴性对照组（P＜0.01）。
　　4.CAR显著抑制氨基酸诱导的SKOV3细胞及Lv-Raptor-shRNA感染SKOV3细胞增殖，但对前者作用更明显（P＜0.01）。
　　5.CAR抑制氨基酸诱导SKOV3细胞的mTOR溶酶体定位和mTOR、S6K1蛋白磷酸化（P＜0.05）。
　　6.Lv-Raptor-shRNA感染SKOV3细胞中mTOR溶酶体定位显著降低；经CAR处理后，慢病毒感染SKOV3细胞中mTOR溶酶体定位进一步降低（P＜0.05）。
　　7.Lv-Raptor-shRNA感染SKOV3细胞中mTOR和S6K1磷酸化水平显著降低；CAR明显抑制氨基酸刺激条件下SKOV3细胞和Lv-Raptor-shRNA感染SKOV3细胞mTOR、S6K1蛋白磷酸化，且对前者抑制更强；经CAR处理后，慢病毒感染SKOV3细胞Raptor表达进一步降低（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.CAR抑制SKOV3细胞增殖的作用与降低Raptor表达有关；
　　2.Raptor介导CAR抑制氨基酸诱导的mTORC1活性。

目录

声明

英文缩略词对照表

前言

材料与方法

1 实验材料

1.1 载体和细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要溶液配制

1.4 主要仪器

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 Raptor基因特异性沉默位点的选择及合成

2.3 靶向Raptor的shRNA慢病毒表达载体构建与鉴定

2.4 氯化钙法制备感受态大肠杆菌

2.5转化感受态大肠杆菌DH5α

2.6 质粒提取

2.7重组慢病毒载体的包装

2.8 确定嘌呤霉素对SKOV3细胞的最低致死浓度

2.9 慢病毒载体感染SKOV3细胞及嘌呤霉素筛选

2.10 细胞计数

2.11 MTT法测定细胞增殖

2.12 SKOV3细胞氨基酸饥饿刺激试验

2.13 免疫荧光共定位mTOR和LAMP2

2.14 Western Blot法检测蛋白的表达

2.15 统计学分析

结果

1 CAR抑制氨基酸诱导的SKOV3细胞增殖

2 CAR抑制SKOV3细胞Raptor蛋白表达

3 Raptor介导小豆蔻明抑制氨基酸激活mTORC1

3.1干扰Raptor表达的SKOV3细胞株确认

3.2 Raptor介导CAR抑制氨基酸诱导的SKOV3细胞增殖

3.3 Raptor介导CAR抑制氨基酸诱导的mTORC1活性

讨论

结论

参考文献

综述：氨基酸调节mTORC1信号通路的研究进展

致谢