异常糖基化修饰在胆囊癌中的特征性改变及其临床意义研究

摘要

第一部分：胆囊癌患者血清N-糖谱分析
　　胆囊癌（gallbladder carcinoma, GBC）是最为常见的胆道系统恶性肿瘤，其恶性程度高，患者五年生存率低，临床上尚无有效的早期筛查方法。近年来，以蛋白质异常糖基化为代表的糖组学的研究，为无创性肿瘤标志物的筛选提供了新的方向。前期本实验室基于 DNA测序仪的荧光糖电泳(DNA sequence-assisted fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, DSA-FACE）技术，在大肠癌、胃癌、胰腺癌、肝细胞癌及多发性骨髓瘤等患者血清中均发现了糖链的特征性变化，同时构建了一系列N-糖指标用于疾病的诊断与鉴别。
　　因此，本部分以前期研究工作为基础，从蛋白质异常糖基化修饰入手，旨于探讨胆囊癌患者血清中 N-糖谱的变化，以期构建高特异性和（或）高灵敏度的胆囊癌诊断模型，为临床提供胆囊癌的预警指标。我们通过DSA-FACE技术对GBC、胆囊炎（chronic cholecystitis, CP）及健康对照（healthy control, HC）三组血清进行N-糖谱检测。N-糖谱分析发现：
　　（1）与CP组及HC组相比，GBC组中二天线糖链结构（peak4-peak6）表达水平降低，而三天线或四天线糖链结构（peak9-peak12）含量显著增多；
　　（2） N-糖谱各峰与CEA无相关性，而peak9'及peak10与CA19-9呈正相关；
　　（3）在GBC组与HC组鉴别诊断中，联合诊断模型GBCglycoA（GBCglycoA=0.07×peak1+0.983×peak9'+1.212×peak12）的AUC值、灵敏度、准确度及约登指数（0.911、80.85%、85.11%、0.70）均高于 CEA（0.749、26.66%、63.83%、0.27）及CA19-9（0.854、59.57%、79.79%、0.60）单项；在GBC组与CP组鉴别诊断中，GBCglycoB（GBCglycoB=0.001×CA19-9+4.429×peak12+2.042）的AUC值、灵敏度、准确度及约登指数（0.844、74.47%、78.72%、0.57）均高于 CEA（0.783、26.66%、63.83%、0.27）及 CA19-9（0.764、59.57%、70.21%、0.40）单项；
　　（4）在CA19-9阴性GBC组与HC组鉴别中， GBCglycoA的AUC值、准确度及约登指数（0.865、73.68%、85.93%、0.63）也均高于CEA（0.71、15.79%、75.76%、0.16）单项；在CA19-9阴性GBC组与CP组鉴别中，GBCglycoB的AUC值、准确度及约登指数（0.792、57.89%、80.70%、0.50）同样高于CEA（0.754、15.79%、75.76%、0.16）单项；
　　（5）在有无淋巴转移的胆囊癌患者诊断中，CEA指标灵敏度虽为100%，但其特异性（25.53%）差，约登指数仅为0.26。N-糖谱peak11的特异度与CA19-9相似，而 peak11的 AUC、灵敏度、准确度及约登指数（0.739、76.92%、76.60%及0.53）明显高于CA19-9（0.545、46.15%、70.72%及0.26）指标。
　　综合上述结果可知：胆囊癌患者血清 N-糖谱中，三天线或四天线糖链结构表达明显升高，联合诊断模型 GBCglycoA及 GBCglycoB不仅为胆囊癌提供了更灵敏的诊断及鉴别指标，也为CA19-9阴性的胆囊癌患者提供了较好的血清学鉴别指标。同时，多天线糖链结构peak11表达水平可作为胆囊癌患者是否淋巴转移的辅诊指标。
　　第二部分：胆囊癌中N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V的生物功能及相关致病机制研究
　　蛋白质糖基化是最为繁杂与多样的蛋白翻译后修饰结构，其是在特定糖基转移酶或糖苷酶的作用下，将糖类物质有序的添加至蛋白质上，并与特定氨基酸序列的特定氨基酸残基形成糖苷键的过程。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 V（N-Acetylglucosaminyltransferase V, GnT-V）是最早被发现的具有明确转录调控途径的糖基转移酶，其主要催化糖复合物形成含有βl，6分支的三天线或四天线糖链结构。研究发现，GnT-V及其产物表达水平的改变与肝癌、乳腺癌等多种肿瘤的恶性程度及预后密切相关。同时，在第一部分实验中我们发现，GBC患者血清中三天线或四天线糖链结构明显增多。
　　因此，本部分研究基于第一部分实验结果，从糖基转移酶方向入手，旨在探讨胆囊癌中GnT-V及其产物的表达水平及生物学功能，为胆囊癌中N-糖谱的特征性改变提供理论依据。首先，我们使用凝集素印迹（Lectin blot, LB）及蛋白印迹（Western blot, WB）方法检测胆囊癌组织中GnT-V及其产物的表达水平，同时挑选GnT-V基础表达水平高的胆囊癌细胞株进行慢病毒干扰。并基于干扰前后细胞株进行细胞功能实验、裸鼠荷瘤实验及转录组测序分析。
　　（1）组织学研究发现：胆囊癌患者的癌组织中，GnT-V的RNA水平、蛋白水平及其产物的含量均显著高于癌旁组织。由此推测：胆囊癌血清中三天线或四天线糖链结构含量的升高可能与GnT-V表达水平增多相关；
　　（2） CCK-8、划痕、Transwell及细胞周期等细胞学实验发现：GnT-V表达下调，抑制胆囊癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，同时抑制细胞周期的进行；
　　（3）裸鼠模型实验发现：GnT-V表达下调，抑制肿瘤的体外生长；
　　（4）细胞转录测序结果发现，干扰前后两组细胞共同表达的基因有23609个（r=0.989），进一步筛选可得6个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），分别为：CGA、EGR1、HAL、PCK1、RASSF9及TNNT2基因。其中，CGA及RASSF9基因在癌组织中高表达，EGR1基因在癌旁组织中高表达，而HAL、PCK1及TNNT2基因在两组中表达无明显差异。KEGG通路分析发现，DEGs主要富集于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等4条信号通路上。
　　综合上述结果表明，GnT-V及其产物在胆囊癌细胞中高表达，高表达的GnT-V及其产物可能通过影响MAPK等信号通路的表达，促进胆囊癌细胞的增殖、侵袭、迁移及致瘤能力。

目录

声明

中常用缩略词

第一部分 胆囊癌患者血清N-糖谱分析

1.1 前言

1.2 材料与方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

1.5 参考文献

第二部分 胆囊癌中N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V的生物功能及相关机制研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 实验结果

2.4讨论

2.5 参考文献

研究工作小结

综述：N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V及其产物在恶性肿瘤中的研究

在读期间发表论文及参加会议情况

致谢