检测可溶性异常糖基化修饰CD58分子的胶乳微球交联特异性单克隆或多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明检测可溶性异常糖基化修饰CD58分子的胶乳微球交联特异性单克隆或多克隆抗体的制备方法，包括步骤：1)胶乳微球的活化；2)胶乳微球与抗CD58单克隆和多克隆IgG抗体交联；3)交联体的洗涤；4)交联体的保存。本发明制备的检测可溶性异常糖基化修饰CD58分子的胶乳微球交联特异性单克隆或多克隆抗体，能与异常糖基化修饰CD58蛋白发生特异性结合反应，而不与正常表达的CD58蛋白和非CD58蛋白发生非特异性反应；用于胶乳免疫比浊法检测外周血或血清异常糖基化修饰CD58分子水平，定量分析样品中异常糖基化修饰CD58含量。

说明书

技术领域

本专利涉及医学检验领域，特别涉及一种检测可溶性异常糖基化修饰 CD58分子的胶乳微球交联特异性单克隆或多克隆抗体的制备方法。

背景技术

CD58分子即淋巴细胞功能相关抗原-3(lymphocytefunctionassociated antigen-3，LFA-3)，是细胞表面的一种跨膜蛋白质分子，属免疫球蛋白超家族 的细胞粘附分子，表达于造血细胞，血管内皮和上皮细胞。CD58分子是T细 胞和自然杀伤细胞(NK细胞)表面CD2分子的配体，体外研究表明CD2与 CD58结合可引起淋巴细胞增殖与活化，这种作用不需要巨噬细胞等辅助细胞 的参与，具有抗原非特异性，为T细胞激活的旁路系统。CD58作为共刺激分 子还与CD2分子结合形成的复合物诱导免疫细胞粘附和活化，从而参与特异 性免疫应答。CD58表达异常与多种自身免疫相关疾病密切相关：CD58特定 位点的突变是多发性硬化和某些类型淋巴瘤发病的危险因素；甲状腺自身免 疫疾病中CD58表达与甲状腺滤泡细胞表面并参与了自身抗原的递呈和识别； 同时银屑病活动期会伴随着CD58+淋巴细胞的大量产生。

CD58分子属于细胞膜性抗原，细胞膜上的CD58分子通常有两种存在形 式，即跨膜形式(TM)和锚定形式(GPI)。近年发现两种分子形式与不同 的细胞信号传导通路相关，锚定形式定位于胞膜脂筏区，跨膜形式定位于非 脂筏区，但在交联作用(cross-linking)下，跨膜形式可重新定位于脂筏区并 独立于锚定形式参与相关细胞信号的传导。CD58主要分布在静止期细胞的细 胞膜上，在活化细胞中的CD58除上述两种形式外，细胞膜表面的CD58可出 现剪切，细胞膜外部分CD58分子可脱落到体液中，即可溶性CD58分子 (sCD58)。已证实从血清、尿及某些细胞系(如HepG2)的培养上清液中 分离到可溶性CD58分子。外周血sCD58水平可间接反映T细胞和NK细胞 的激活状态。CD58分子是一种高度糖基化蛋白，作为T细胞表面糖蛋白受体 CD2分子的配体，两者结合形成复合物介导多种类型细胞的细胞间粘附。CD2 分子的胞外氨基末端结构域包含一个N-连接型糖基化位点，该结构域中天冬 酰胺(Asn)N-连接型糖基化在CD2与CD58分子的结合及相互作用中起关 键作用，对CD2分子细胞粘附功能有重要影响，然CD58分子糖基化修饰的 改变对分子功能及细胞间相互作用的影响目前尚缺乏相关研究。

CD58可能是一个潜在的肿瘤标志物之一。在血液系统恶性肿瘤中，CD58 被认为是未成熟肿瘤细胞的标志分子。正常B细胞在成熟过程中CD58表达 逐渐减弱，然而在前体B细胞白血病其表达较任何分化阶段的正常细胞都要 高，提示CD58在诊断和监测前体B细胞白血病微小残留灶中具有重要价值。 急性淋巴细胞性白血病中恶性前体B细胞的CD58表达显著高于非恶性B细 胞；在胃癌等实体肿瘤中高水平CD58表达与低存活率正相关，同时CD58可 能参与肿瘤血管侵犯及淋巴结转移。最新的研究显示CD58是一群结直肠癌肿 瘤干细胞的表面标志。利用化疗药物短期作用浓聚干细胞的方法，将大肠癌 原代细胞系分别经5-FU和奥沙利铂作用2周后，FCM检测发现CD58阳性细 胞被明显富集。进一步对其基因表达谱特征扫描发现，与CD58阴性大肠癌细 胞比较，CD58阳性大肠癌细胞具有低水平分泌数个趋化因子的能力。用酶联 免疫吸附法(ELISA)测定发现药物富集组细胞趋化因子8(CXCL-8)水平明显 高于对照组。同样经无血清培养的CD58+克隆球细胞CXCL-8水平也明显升 高。CXCL-8是一种CXC型炎症趋化因子，CXCL-8可激活并增强肿瘤血管 内皮细胞的增殖和抗凋亡能力，促进趋化因子受体CXCR1、CXCR2和MMP-2 的表达，从而促进肿瘤血管生成和肿瘤细胞的侵袭和迁移。近来研究还表明 CXCL-8可协同上皮间质化转录因子Snai1促进大肠癌干细胞的增殖。以上研 究结果提示CD58是一个潜在的监测肿瘤疾病进展和评价肿瘤预后的靶分子 之一。

肿瘤细胞表达的CD58蛋白在其分子结构和表面修饰上不同于正常细胞 表达的CD58。Challa-MalladiM等发现约20％淋巴瘤细胞表达的CD58DNA 存在碱基突变、缺失和拼接改变。用免疫荧光检测发现大肠癌肿瘤组织中 CD58分子大量表达于肿瘤细胞胞浆内；进一步对原代新鲜分离的大肠癌细胞 用FCM检测发现大肠癌细胞膜表达CD58阳性细胞<5％，上述研究提示大肠 癌细胞表达的CD58蛋白在其分子结构和表面修饰上不同于正常细胞表达的 CD58。除信号肽外，近年研究表明蛋白质关键糖基化改变也可影响蛋白质的 正确定位。机体内蛋白质多数为糖蛋白，蛋白质翻译后糖基化修饰是最普遍 也是最重要的一种加工方式。糖蛋白糖链影响蛋白质折叠、稳定、定位及运 输等，并参与如分化与去分化、细胞转化与识别、信号传导、免疫与应答等 多种生命现象的调节。在肿瘤的发生发展过程中糖蛋白的糖基化程度或糖链 结构发生了改变，导致糖蛋白及其所在细胞功能异常，进而出现恶性表型。 糖链结构变化与恶性肿瘤密切相关，涉及肿瘤细胞生长、黏附和转移等许多 重要的生理和病理过程，甚至参与肿瘤细胞的免疫选择和克隆进化。

肿瘤细胞中蛋白质糖基化修饰出现特异性改变。蛋白质糖基化具有糖苷 的多样性、修饰的复杂性及微观不均一性等，这使得糖基化蛋白结构异常复 杂。目前研究发现人体内至少有41种糖基化形式，但主要以两种形式存在， 即天冬酰胺(Asn)连接的N-连接型糖链(N-linkedglycosylation)和丝氨酸 或苏氨酸(Ser/Thr)连接的O-连接型糖链(O-linkedglycosylation)二类。肿瘤 细胞中糖基化修饰也有多种形式，如特定结构的糖链表达量差异、不完整糖 链结构的出现、新糖链结构的出现等。研究发现岩藻糖基化修饰改变和唾液 酸化程度改变等是肿瘤中常见的糖基化修饰改变。肝癌中蛋白质岩藻糖基化 修饰增加，胰腺癌中LewisX唾液酸和岩藻糖基化修饰增加。糖蛋白糖链结 构变化与肿瘤发生发展的密切关系已日益成为肿瘤研究的关注热点。糖链变 化具有肿瘤特异性，几乎每种恶性肿瘤都具有各自特征性的糖链变化，已有 的发现涉及肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等。如肝癌相关 糖蛋白甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)，利用小扁豆凝集素(LCA)可将 AFP分成多种糖链结构不同的异质体，其中LCA结合型AFP具有肝癌特征 性，又称为岩藻糖基化AFP或AFP-L3，2005年美国FDA确定AFP-L3为肝 癌诊断的标志物。测定具有特征性的肿瘤糖蛋白异常分子修饰现已成为利用 “糖链标志”诊断肿瘤的新思路。尤其在肿瘤发生早期，这些“糖链标志” 或可扮演特异性先锋信号的作用而达到肿瘤早期诊断的目的。

在对大肠癌细胞的研究中发现，大肠癌组织来源CD58分子在基因结构上 与正常肠上皮来源并无差异性，然在大肠癌细胞中CD58分子存在异常的糖基 化修饰，即异常糖基化修饰CD58，几乎所有的大肠癌细胞均表达异常糖基化 修饰CD58。因而，外周血异常糖基化修饰CD58水平可能是一个潜在的、新 的肿瘤标志物之一。目前国内尚无建立外周血或血清异常糖基化修饰CD58 检测方法。血清抗原的检测方法主要有酶联免疫吸附法、化学发光法和胶乳 免疫比浊法等。传统的酶联免疫吸附法因检测时间长，灵敏度低而逐渐被新 技术所取代。其中，胶乳免疫比浊法检测速度快，定量准确，适用于临床自 动化检验。

发明内容

本发明介绍了一种检测可溶性异常糖基化修饰CD58分子的胶乳微球交 联特异性单克隆或多克隆抗体的制备方法，用于血浆等体液可溶性异常糖基 化修饰CD58蛋白分子检测，为肿瘤高危人群浓缩和大肠癌早期诊断提供一种 新的肿瘤标志物。

本发明提供的检测可溶性异常糖基化修饰CD58分子的胶乳微球交联特 异性单克隆或多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

1)胶乳微球的活化：取胶乳微球于胶乳活化缓冲液中，采用超声波进行 乳化活化后，脱盐并去除残留活化物，完成活化；

2)胶乳微球与抗CD58单克隆和多克隆IgG抗体交联：于垂直混合仪中 加入活化后的胶乳微球和抗异常糖基化修饰CD58分子单克隆/多克隆IgG抗 体，混匀并反应后，加入甘氨酸缓冲液混合均匀，得到交联体；

3)交联体的洗涤：将交联体离心后取沉淀，用洗涤液重悬沉淀后离心取 沉淀，重复3-5次，完成洗涤；

4)交联体的保存：将洗涤后的交联体沉淀于甘氨酸保存液中超声混匀， 4℃保存。

进一步的，所述步骤1)中胶乳微球为直径为100-165nm的聚苯乙烯胶乳 微球。

进一步的，所述步骤1)中胶乳活化缓冲液的配方为0.05-0.5M/LpH5.5-7.5 的MES缓冲液、水、吐温-20、19.2mg/mLNHS和52mM/LEDAC。

进一步的，所述0.05-0.5M/LpH5.5-7.5的MES缓冲液、水、吐温-20、 19.2mg/mLNHS和52mM/LEDAC的配比为1:1.5:0.01-0.015:0.5-1.5:2-4。

进一步的，所述步骤1)中脱盐并去除残留活化物的方法为流穿葡聚糖 G-25凝胶柱方法。

进一步的，所述步骤2)中活化后的胶乳微球与抗异常糖基化修饰CD58 分子单克隆/多克隆IgG抗体的配比为1ml:0.1-1.2mg，所述抗异常糖基化修饰 CD58分子单克隆/多克隆IgG抗体预先溶解于PB缓冲液后再与胶乳微球混 合。

进一步的，所述PB缓冲液为100mM/L，pH7.4的PB缓冲液。

进一步的，所述步骤2)中甘氨酸缓冲液为0.1-1.0M/L，pH7.4的甘氨酸 缓冲液。

进一步的，所述步骤3)中洗涤液为内含0.1％BSA的50mM/L，pH7.4 甘氨酸缓冲液。

进一步的，所述步骤4)中甘氨酸保存液为内含0.1％BSA，0.1-1.0％PVP， 0.05％NaN₃的50mM/L，pH7.4甘氨酸缓冲液。

本发明制备的检测可溶性异常糖基化修饰CD58分子的胶乳微球交联特 异性单克隆或多克隆抗体，能与异常糖基化修饰CD58蛋白发生特异性结合反 应，而不与正常表达的CD58蛋白和非CD58蛋白发生非特异性反应；用于胶 乳免疫比浊法检测外周血或血清异常糖基化修饰CD58分子水平，当样品中含 有异常糖基化修饰CD58时，交联特异性抗体的胶乳微球可由于抗原抗体特异 性结合发生凝集，造成浊度增加，通过测定样品吸光度变化，对照标准曲线， 定量分析样品中异常糖基化修饰CD58含量，检测效能与ELISA(酶联免疫 吸附法)、化学发光免疫检测法接近或等效。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了 解，使用实施例进一步阐述本发明。

1.异常糖基化修饰CD58分子单克隆IgG抗体制备方法

1.1动物免疫

1х106大肠癌LoVo细胞用RNAeasy试剂盒分离纯化总RNA，经Oligo dT15引物将总RNA逆转录为cDNA，用聚合酶链式反应(PCR)将人CD58基 因序列(NM_001779.2)扩增，经EcoRI/BamH1酶切后，克隆至pLXSN逆转录 病毒载体，DNA测序验证，构建CD58表达逆转录病毒载体系统，转染PT67 细胞，生产重组逆转录病毒，按10:1滴度感染大肠癌SW620细胞，用500-700 μg/mL的G418药物压力筛选阳性克隆7-14天。扩大培养，用免疫印迹法 (Westernblot)方法验证异常糖基化修饰CD58表达状况。用于制备异常糖基化 修饰CD58分子单克隆抗体的大肠癌SW620细胞应强阳性表达外源性过表达 CD58蛋白。

进一步以外源性过表达CD58分子的大肠癌SW620细胞尾静脉注射免疫 Balb/c雌性小鼠(8-10周龄，体重18-20g)，每次免疫1х106细胞/只)。每周1 次，连续4周，后续分别于第5周、第7周和第9周使用无佐剂细胞抗原直 接腹腔注射免疫，间隔1周后采用尾静脉/腹腔加强免疫1次，3天后细胞融 合。

1.2杂交瘤细胞的制备

按照常规细胞融合方法进行。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按 1:6在50％PEG(MW400-800)的作用下融合，融合细胞先在次黄嘌呤-氨甲 喋呤-胸腺嘧啶(HAT)选择培养基中培养，2周后可换为次黄嘌呤-胸腺嘧啶(HT) 培养基，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养。待克隆孔长至1/3-1/2时， 取培养上清液进行抗体检测。

1.3特异性克隆孔筛选

用间接ELISA法筛选阳性孔。用0.1％戊二醛处理反应微孔30min，用磷 酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，加入1*105的过表达CD58分子的大肠癌SW620 细胞，室温反应120min，用PBS洗涤3次，用10％小牛血清室温封闭30min， 再加入100μl上述培养上清液室温反应60min，用PBS洗涤3次，最后再加入 1:2000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP室温反应60min，用PBS洗涤3次，加入四 甲基联苯氨(TMB)底物显色观察。凡出现明显蓝色反应者为阳性，否则为阴性。 阳性孔进一步进行竞争抑制ELISA法筛选。

用竞争抑制ELISA法筛选异常糖基化修饰CD58分子单克隆抗体。用 0.1％戊二醛处理反应微孔30min，用PBS洗涤3次，加入1*105的源自正常 人外周血的淋巴细胞，室温反应120min，用PBS洗涤3次，用10％小牛血清 室温封闭30min，再加入100μl上述培养上清液室温反应60min，用PBS洗涤 3次，最后再加入1:2000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP室温反应60min，用PBS 洗涤3次，加入TMB底物显色观察。凡出现明显蓝色反应者为阳性，否则为 阴性。凡与正常人淋巴细胞有反应的克隆孔应丢弃，保留阴性孔，再进行有 限稀释法进行3次亚克隆，建株的杂交瘤细胞再扩大培养、冻存、制备腹水。

1.4腹水的制备和纯化

将稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞扩大培养后，接种到预先用降植烷 或液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，7-12天内观察，收取腹水，离心后测 定效价。经50％饱和硫酸铵沉淀保存或者低温冻存。腹水采用50％饱和硫酸 铵沉淀-正辛酸沉淀，或者用50％饱和硫酸铵沉淀-rProteinA-SepharoseFast Flow亲和层析纯化，最后用SDS-PAGE检测纯度，需达到90％。

2.异常糖基化修饰CD58分子多克隆IgG抗体制备方法

以上述制备的固相化抗异常糖基化修饰CD58分子单克隆抗体 CD58/Sepharose4B柱从表达CD58分子的大肠癌SW620细胞和新鲜大肠癌组 织匀浆中用亲和层析法分离异常糖基化修饰的CD58蛋白，再用Sephadex G-100进一步分离纯化糖基化修饰CD58蛋白，Lorroy’s酚试剂进行蛋白质 定量。以100-250μg/次/只CD58蛋白与完全福氏佐剂混匀，家兔皮下多点注 射免疫。每1-2周1次，连续5次，间隔1周后采用分离颈动脉，收集血液约 80-100毫升，室温放置2小时，4℃10000rpm离心30min，分离收集血清。 上述血清首先流过源自正常淋巴细胞的CD58蛋白-Sepharose4B亲和层析柱， 以去除与正常CD58蛋白有交叉反应的抗体，然后再用异常糖基化修饰CD58 蛋白-Sepharose4B亲和层析柱纯化抗异常糖基化修饰CD58蛋白的特异性 IgG抗体，最后用SDS-PAGE检测纯度，需达到90％。

3.胶乳微球交联CD58单克隆或多克隆IgG抗体方法(以活化交联4ml 的1％胶乳-抗体为例)

3.1胶乳活化

3.1.10.05-0.5M/LMES缓冲液(pH5.5-7.5)1ml，直径100-165nm的10％ 胶乳0.4ml，水1.5ml，吐温-2010-15μl，涡旋振荡混匀。

3.1.2加入19.2mg/mLNHS0.5-1.5ml，52M/LEDAC2-4ml，涡旋振荡15-30 分钟。

3.1.3混合液超声5次，每次超声5秒，间隔15秒，超声能量6000kJ。 过SephadexG-25葡聚糖凝胶柱，用水洗至终体积20ml。

3.2抗异常糖基化修饰CD58分子单克隆/多克隆IgG抗体与胶乳交联的优 化

3.2.1上述活化的胶乳液1.0ml，分别与0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mg 抗异常糖基化修饰CD58分子单克隆/多克隆抗体(分别溶于1.0ml100mM/L， pH7.4PB缓冲液中)混匀后，于垂直混合仪反应1-3小时。

3.2.2分别加入0.1-1.0M/L，pH7.4甘氨酸缓冲溶液1ml于垂直混合仪混 合15-60分钟，以封闭残留的活性基团。

3.3交联物的分离

3.3.1上述抗体胶乳混合液15000-20000rpm离心15-60分钟，弃上清，保 留沉淀。

3.3.2用洗涤液40ml重悬沉淀(洗涤液：50mM/L，pH7.4甘氨酸缓冲溶液 内含0.1％BSA)，15000-20000rpm离心15-60分钟。

3.3.3重复3.3.2步骤3-5次。

3.4抗异常糖基化修饰CD58分子单克隆/多克隆IgG抗体与胶乳交联物的 保存

上述胶乳沉淀中加入4ml50mM/L，pH7.4甘氨酸缓冲溶液内含0.1％ BSA，0.1-1.0％PVP，0.05％NaN₃，超声5秒混匀，4℃保存。

3.5抗异常糖基化修饰CD58分子单克隆/多克隆IgG抗体与胶乳交联最 佳浓度的确定

3.5.1主要试剂组成成分

试剂R1：三羟甲基氨基甲烷缓冲液20-100mM/L，pH6.0-8.5；PEG(MW 4000-8000)40g/L；BSA5g/L

试剂R2：不同交联CD58单克隆或多克隆抗体的胶乳微球。

3.5.2检测步骤

反应类型：速率法温度：37℃比色杯光径：0.6cm

主/副波长：546nm/800nm单位：U/ml反应方向：上升

3.5.3结果确定：

计算校准品吸光度的差值(A校准-A空白)，建立合适的数学模(非线性) 如Logit-Log等，拟合成多点定标的校准曲线。根据各胶乳校准曲线的反应变 化幅度、线性范围、相关系数和反应可重复性确定最佳的抗体与胶乳比例。

4.血浆可溶性异常糖基化修饰CD58蛋白分子检测

4.1主要试剂组成成分

试剂R1：三羟甲基氨基甲烷缓冲液20-100mM/L，pH6.0-8.5；

PEG(MW4000-8000)40g/L；BSA5g/L

试剂R2：交联CD58单克隆或多克隆抗体的胶乳微球

4.2检测步骤

反应类型：固定时间2点法温度：37℃比色杯光径：1.0cm

主/副波长：546nm/800nm单位：U/ml反应方向：上升

4.3结果计算：

计算校准品吸光度的差值(A校准-A空白)，建立合适的数学模(非线性) 如Logit-Log等，拟合成多点定标的校准曲线。根据样品(A样品-A空白)的吸 光度差值，在工作曲线上求得样品中异常糖基化修饰CD58蛋白的含量。

本实施例制备的检测可溶性异常糖基化修饰CD58分子的胶乳微球交联 特异性单克隆或多克隆抗体，能与异常糖基化修饰CD58蛋白发生特异性结合 反应，而不与正常表达的CD58蛋白和非CD58蛋白发生非特异性反应；用于 胶乳免疫比浊法检测外周血或血清异常糖基化修饰CD58分子水平，当样品中 含有异常糖基化修饰CD58时，交联特异性抗体的胶乳微球可由于抗原抗体特 异性结合发生凝集，造成浊度增加，通过测定样品吸光度变化，对照标准曲 线，定量分析样品中异常糖基化修饰CD58含量，检测效能与ELISA(酶联 免疫吸附法)、化学发光免疫检测法接近或等效。