南瓜蛋白单克隆抗体的制备及在纯化南瓜蛋白中的应用

摘要

研究目的：
　　通过构建和筛选南瓜蛋白杂交瘤阳性株，以及制备和纯化南瓜蛋白单克隆抗体，从而构建南瓜蛋白免疫亲和层析柱，并探索南瓜蛋白单克隆抗体的初步应用。
　　研究方法：
　　一、南瓜蛋白单克隆抗体的制备及纯化
　　1.用天然提取的南瓜蛋白免疫Balb/C小鼠,融合小鼠骨髓瘤SP2/0细胞和南瓜蛋白免疫的小鼠脾细胞来构建杂交瘤细胞;
　　2.通过HAT培养基和亚克隆培养筛选阳性株；
　　3.液体石蜡致敏Balb/C小鼠，通过腹腔注射杂交瘤阳性株诱生腹水来制备南瓜蛋白单克隆抗体；
　　4.通过饱和硫酸铵（SAS）盐析法和Protein G亲和层析法来纯化南瓜蛋白单克隆抗体；
　　5.通过SDS-PAGE对比南瓜蛋白单克隆抗体纯化前后效果；
　　二、南瓜蛋白单克隆抗体的鉴定及检测
　　1.通过蛋白免疫印迹法（Western blotting，WB）识别南瓜蛋白单克隆抗体对南瓜蛋白及以其为效应分子的免疫毒素；
　　2.通过间接酶联免疫吸附法（indirect EnzymeLinkedImmunosorbantAssay，iELISA）检测南瓜蛋白单克隆抗体的效价；
　　3.通过octect检测南瓜蛋白单克隆抗体的亲和力；
　　4.通过抗体亚型试剂盒检测抗体亚型；
　　三、南瓜蛋白免疫亲和层析柱的构建及应用
　　1.通过CNBr活化的Sepharose4B偶联南瓜蛋白单克隆抗体，从而构建南瓜蛋白免疫亲和层析柱；
　　2.用构建的南瓜蛋白免疫层析柱来纯化南瓜蛋白及以南瓜蛋白为效应分子的免疫毒素；
　　3.通过SDS-PAGE对比南瓜蛋白和以南瓜蛋白为效应分子的免疫毒素的纯化前后效果；
　　4.通过磺酰罗丹明（SRB）比色法检测纯化后的南瓜蛋白及南瓜蛋白为效应分子的免疫毒素的体外抗肿瘤活性。
　　研究结果：
　　1.获得3株特异性强，亲和力高的南瓜蛋白单克隆抗体（1B2，1G9，2E12）；
　　2.经检测,南瓜蛋白单克隆抗体的效价均为1∶10000000；
　　3.经检测,三株南瓜蛋白单克隆抗体均为IgG1，κ亚型；
　　4.经检测,三株南瓜蛋白单克隆抗体和南瓜蛋白的亲和力KD值均小于10-12；
　　5.成功纯化1B2,1G9两株南瓜蛋白单克隆抗体；
　　6.成功构建具有南瓜蛋白特异性的免疫亲和层析柱;
　　7.经检测，纯化后的南瓜蛋白及南瓜蛋白为效应分子的免疫毒素仍具有体外抗肿瘤活性。
　　研究结论：
　　1.成功制备三株高特异性，高亲和力的南瓜蛋白单克隆抗体（1B2，1G9，2E12），亚型均为IgG1，kappa；
　　2.成功构建了南瓜蛋白特异性的免疫亲和层析柱；
　　3.通过免疫亲和层析柱成功纯化了天然南瓜蛋白，重组南瓜蛋白以及以南瓜蛋白为效应分子的免疫毒素。

目录

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