南瓜韧皮液mRNA结合蛋白的纯化与CmRBP50核糖核蛋白复合体形成的分子机制

摘要

植物韧皮部作为植物维管束重要的组成部分，不仅充当着同化碳水化合物的运输通道，更因其内含激素、活性氧、钙离子、RNA与蛋白等信息物质而充当着协调植物系统生长与发育的信息高速公路。植物维管系统对于植物响应环境逆境变化也起着举足轻重的作用，深入了解植物韧皮部长距离信号物质及其作用可提供提高农作物生产率的手段。南瓜因其维管柬分明，容易采集韧皮液而成为研究维管束系统最好的模式植物之一。目前其韧皮液内RNA转录组与蛋白质组已获得，但是我们对其韧皮液内上千RNA与蛋白的研究还只是冰山一角，仍有很多问题尚待研究。本实验室此前研究发现了RNA结合蛋白CmRBP50在南瓜韧皮液内形成了一个核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)复合体，这是目前为止在植物中获得的第一个能进行长距离运输的核糖核蛋白复合体，但是关于此复合体的形成机制还不清楚。本文以南瓜(Cucurbita maxima cv Big Max)为材料，通过生物化学、分子生物学等手段研究了南瓜韧皮液内可能的mRNA结合蛋白及基于CmRBP50核糖核蛋白复合体的形成分子机理。取得主要结果如下：
　　 1.运用蛋白质组学手段研究了南瓜韧皮液内可能的mRNA结合蛋白。通过Poly(U)亲和柱结合液相串联质谱(LC-MS/MS)技术获得了南瓜韧皮液内29个潜在的mRNA结合蛋白。其功能包括与RNA代谢、翻译相关，与蛋白代谢、运输相关，与细胞结构、能量产生相关，与代谢相关及一些功能未知的蛋白。
　　 2.研究了CmRBP50的磷酸化位点及其对于CmRBP50RNP形成的重要性。首先通过蛋白overlay技术明确了磷酸化修饰对基于CmRBP50RNP形成的重要性，然后通过液相串联质谱鉴定获得了四个磷酸化位点丝氨酸223、438、440和444。通过点突变及小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchiniyellow mosaic virus，ZYMV)表达系统表达并纯化获得了CmRBP50及S223A(丝氨酸223突变为丙氨酸)，STripleA(丝氨酸438、440、444分别突变为丙氨酸)，SQuadA(丝氨酸223、438、440、444分别突变为丙氨酸)等点突变蛋白。蛋白overlay与免疫共沉淀技术证实了以上磷酸化位点对于此RNP形成的重要性，尤其是C端Ser438、440和444突变为丙氨酸后可充分剥离CmRBP50与其他蛋白间的互作。最后，我们克隆并表达了CmRBP50的潜在互作蛋白，运用体外pull down技术证实CmRBP50与CmPP16，GTPbP及PSPL可发生体外互作，且其C端的磷酸化修饰对其互作至关重要。
　　 3.研究了可能磷酸化CmRBP50的激酶。通过运用胶内磷酸化(In gel kinaseassay)技术从维管束蛋白与韧皮液蛋白着手，鉴定了可能磷酸化CmRBP50的激酶。通过对可疑位点质谱鉴定我们得到核苷二磷酸激酶，丝/苏氨酸激酶，蛋白激酶adk1和蛋白激酶Csa000515及糖原合成酶激酶-3等可能的激酶，经论证推测最有可能的是糖原合成激酶-3。
　　 本文通过对韧皮液内mRNA结合蛋白的初步鉴定及对首个韧皮液内发现的能进行长距离运输的基于CmRBP50的RNP形成机制研究，将为揭开CmRBP50在韧皮液中介导的生理功能打下基础，同时为研究韧皮液内其他RNP提供依据。本研究最终不仅有助于我们揭示不同器官间的通讯机制或信号转导机制，丰富植物生理学、生态学和园艺学的知识，也可为我们利用植物的通讯机制来应用到农业生产，探索出一条提高蔬菜的抗性、产量及品质的新途径，这具有十分重要的科学与现实意义。

目录

文摘

英文文摘

致谢

缩略词表

1 引言

1.1 植物韧皮部结构概述

1.1.1 韧皮部基本结构

1.1.2 韧皮部物质转运机理-压力流动学说

1.1.3 韧皮液采集方法

1.2 植物韧皮液内RNA介导的信号调控

1.2.1 类病毒或RNA病毒

1.2.2 植物内源RNA

1.2.3 小RNA

1.3 植物韧皮液内蛋白介导的信号调控

1.4 韧皮部RNA与蛋白运输机制

1.5 韧皮部长距离信号转导与逆境响应

1.6 本文的研究内容、目的意义

2 南瓜韧皮液内mRNA结合蛋白的分离纯化及蛋白质组分析

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 南瓜韧皮液的收集

2.1.3 南瓜韧皮液蛋白的阴离子亲和交换

2.1.4 Poly(U)亲和柱纯化分离mRNA结合蛋白

2.1.5 Trypsin胶内酶切及LC-MS/MS分析

2.1.6 Western印迹分析

2.2 结果与分析

2.2.1 南瓜韧皮液内RNA结合蛋白的分离纯化

2.2.2 韧皮液内mRNA结合蛋白的分析

2.2.3 CmRBP50的验证

2.3 讨论

3 CmRBP50磷酸化位点的分析及其对于CmRBP50核糖核蛋白(RNP)复合体形成的影响

3.1 材料与方法

3.1.1 植物材料

3.1.2 载体构建

3.1.3 常规方法

3.1.4 RACE合成全长cDNA

3.1.5 点突变构建CmRBP50突变蛋白

3.1.6 基因枪转化

3.1.7 本氏烟浸润法表达重组蛋白

3.1.8 植物重组蛋白纯化

3.1.9 Western

3.1.10 蛋白Overlay

3.1.11 Pull-down与免疫共沉淀技术(Co-immunoprecipitation)

3.1.12 Pro-Q Diamond、Emerald染色，Sypro Ruby染色

3.2 结果与分析

3.2.1 翻译后修饰对于基于CmRBP50RNP形成的重要性

3.2.2 CmRBP50磷酸化位点的鉴定

3.2.3 Ser223、438、440与444磷酸化修饰对于CmRBP50RNP的形成起着重要作用

3.2.4 CmRBP50直接互作蛋白的克隆、纯化与鉴定

3.2.5 CmRBP50 C端磷酸化修饰对于其与CmPP16，CmGTPbP，CmPSPL互作的影响

3.3 讨论

4 CmRBP50磷酸化激酶的分离鉴定

4.1 材料与方法

4.1.1 植物材料

4.1.2 CmRBP50大肠杆菌体外重组蛋白的表达和纯化

4.1.3 南瓜维管束蛋白与韧皮液蛋白的提取

4.1.4 利用FPLC进行阴离子、阳离子吸附交换分离维管束蛋白与韧皮液蛋白

4.1.5 胶内磷酸化

4.1.6 LC-MS/MS分析

4.2 结果与分析

4.2.1 CmRBP50体外重组蛋白的大量纯化

4.2.2 维管束与韧皮液总蛋白中CmRBP50磷酸化激酶的分离鉴定

4.2.3 FPLC分离后维管束与韧皮液蛋白中CmRBP50磷酸化激酶的分离鉴定

4.2.4 可能的CmRBP50磷酸化激酶

4.3 讨论

5 结论与展望

参考文献

附录A 常用缓冲液及培养基配方

附录B 常用化学试剂、分子生物学试剂

作者简历