基于转录组定性特征的肿瘤生物信息学分析方法与应用

摘要

在检测肿瘤组织的基因表达时，由于受到如下诸多因素影响，检测值存在很大的不确定性：（1）检测的高变异与批次效应；（2）肿瘤组织取样部位的癌细胞占比变化；（3）在样本采集、预处理等过程中的RNA部分降解；（4）微量RNA的扩增偏倚。因此，―精细‖的基因表达定量信息并不可靠。相反，转录组的定性特征，即样本内的基因表达检测值的相对大小秩序关系（RelativeExpression Orderings,REOs）高度稳健，并蕴含了丰富的疾病信息：REOs在正常组织中高度稳定，而在肿瘤组织中发生了广泛的扰动。因此，针对四个肿瘤研究的四个常见问题，本文进一步发展与应用基于REOs分析的肿瘤生物信息学方法。
　　1．整合独立数据识别差异表达基因的REOs分析方法
　　在许多肿瘤研究问题中，待比较的两类样本间基因表达的差异信号非常微弱，常规方法很难识别出可重复的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）。由于检测的批次效应，无法将来源于多个实验室的数据合并分析，而目前的矫正批次效应的算法存在很大的偏倚。本实验室已开发了一种利用REOs关系识别DEGs的算法，通过分析在单个疾病样本中的REOs相对在大样本正常组织中高度稳定的REOs的逆转关系，识别个体水平的DEGs。
　　本课题通过预先识别在疾病组样本中显著稳定的REOs，使RankComp算法适用于识别群体水平的DEGs，记为RankCompV2。由于样本内的REOs高度稳健，提出了直接将由不同实验室检测的数据合并，再利用RankCompV2识别DEGs的方法。利用9组数据评价，结果显示该整合分析方法可有效提高DEGs识别的效能与准确度。利用此方法，通过合并五组数据集中接受紫杉醇联合新辅助化疗的ER阴性和ER阳性乳腺癌样本，分别在ER阴性及ER阳性的响应组和非响应组间识别了409与206个DEGs。两组DEGs分别富集于DNA修复及免疫相关的通路，暗示两种乳腺癌亚型可能有不同的耐药机制。
　　2．识别在癌细胞中mRNA绝对量异常基因的REOs分析方法
　　癌细胞多为多倍体或非整倍体，其细胞内的总RNA含量比正常细胞高数倍。因此，当从两类细胞提取相同总量RNA进行基因表达检测、比较时，只能识别两类细胞间mRNA浓度（而不是绝对量）存在差异的基因。
　　在本研究中，通过数学推理，证明了基于两类样本间的逆转REOs识别的DEGs的mRNA绝对量与浓度在两类细胞间都有差异。利用RankCompV2分析了乳腺癌等10种癌型的基因表达谱数据，发现肿瘤细胞相对正常细胞存在mRNA绝对量差异的基因显著富集了肿瘤驱动基因及抗癌药物的靶基因，可能是肿瘤转录异常中的上游事件。在肿瘤细胞中，mRNA绝对量上调的DEGs富集在DNA损伤相关的通路，而mRNA绝对量下调的DEGs富集在免疫和代谢相关的通路。
　　3．基于REOs的术后复发风险及耐药预测二联标志—ER阳性乳腺癌案例
　　对于接受根治性手术切除治疗的早期ER阳性乳腺癌患者，已分别报道了一些术后复发（即微转移）风险预测标志及术后接受他莫昔芬治疗的复发（即耐药）风险预测标志。但是，在利用接受根治性手术并接受他莫昔芬治疗患者的生存信息识别耐药标志时，会受到样本中无微转移患者的生存信息的干扰而产生偏倚。
　　因此，提出利用术后复发风险预测标志辅助识别他莫昔芬耐药预测标志的方法。利用544个只接受手术治疗患者的表达谱数据，构建和验证了由9对基因组成的术后复发风险预测标志；然后，在840个术后他莫昔芬治疗的患者中，利用此标志识别出553个术后高复发风险患者，再根据这些患者的表达谱数据构建和验证了由10对基因组成的术后他莫昔芬治疗的复发风险预测标志。这组二联标志具有稳健的术后复发(微转移)风险及耐药预测能力。
　　4．基于REOs的肿瘤亚型鉴别—乳腺癌ER状态鉴别案例
　　采用免疫组化检测鉴别乳腺癌的ER状态受试剂、检测者的经验等影响，存在较大的偏差。利用四组乳腺癌数据，识别了112对基因，其REOs分别在ER阴性与ER阳性乳腺癌组织中显著稳定但是REOs模式相反。通过分析这些基因对在每个样本的REOs是否显著多地与ER阴性或ER阳性样本中的REOs模式相同，重新鉴别ER的状态。通过评价重分类的ER阴性或ER阳性患者是否能获益于相应的他莫昔芬治疗或新辅助化疗，验证了此标志的有效性。这个基于REOs的分子标志能够客观判定乳腺癌患者的ER状态，减少临床上免疫组化检测的错误评定。
　　综上，发展了基于转录组定性特征分析的肿瘤生物信息学方法，分别应用于整合分析独立数据、识别肿瘤的mRNA绝对量异常基因、构建肿瘤（乳腺癌）的预后及分型标志。利用这些稳健的分析方法，有助于肿瘤标志的识别及临床转化研究。