罗伦隐球酵母B40脂肪酶的分离纯化及扩展青霉脂肪酶突变体的构建

摘要

本论文阐述了对罗伦隐球酵母B40的发酵配方改良、该菌产生的脂肪酶的纯化及酶学特性等方面的研究。通过对发酵培养基的优化，确定了其适宜的发酵配方；通过硫酸铵沉淀、DEAE SephadexA-25离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析等纯化步骤，对其发酵液进行了纯化，得到了电泳纯脂肪酶；通过SDS-PAGE初步确定其表观分子量约为21 KD。并对其作用温度和pH等酶学特性进行了研究。本论文还阐述了利用定点突变技术创建扩展青霉脂肪酶(PEL)的随机突变体ep8与R182K的叠加突变体，其酶活与野生型PEL和随机突变体PEL-ep8相比都有所提高。 1.罗伦隐球酵母B40脂肪酶的分离纯化及特性分析罗伦隐球酵母B40是一株可以分泌脂肪酶的酵母菌。作者设计了多种培养基配方对其发酵培养基进行优化。通过考查其菌体生长、发酵酶活及是否有利于分离纯化等指标。确定了菌体生长好、发酵酶活高并易于分离纯化的培养基配方：玉米粉0.5％，豆饼粉 2％，(NH<,4>)<,2>SO<,4>.0.1％，Na<,2>HPO<,4>12H<,2>O 0.2％，MgSO<,4>'7 H<,2>O0.25％，CaCl<,2> 0.01％，发酵培养基初始pH7.2。 通过硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-25离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析等步骤，作者从C.laurentii B40 的发酵上清中纯化获得了电泳纯脂肪酶。该酶可在三丁酸甘油酯检验板上形成水解透明圈，其表观分子量约为21KD，是一种分子量较小的脂肪酶。该酶在35-45℃的范围内，有较高活性，其最适作用温度为43℃。在pH 9.2-12.2的范围内，酶的活性较高，其最适作用pH为pH10.7；在55℃以下，pH5.0-11.2的范围内，该酶有很好的稳定性。在所检测的金属离子中，多数对该酶酶活有抑制作用，尤其是Zn<'2+>、Hg<'2+>、Cu<'2+>、Al<'3+>；表面活性剂0.05％Triton-100、0.5mM sodium Desoxycholate 对该酶酶活有明显的促进作用，0.05％SDS、0.05％ EDTA 则对其有强烈的抑制作用。该酶对短链的脂肪酶具有偏爱性。作者还对该脂肪酶进行了N 端序列的测定，但由于该脂肪酶的N端可能是封闭的，目前还未获得其N端氨基酸序列。 2.扩展青霉脂肪酶叠加突变体PEL-ep8-R182K的构建利用重叠延伸PCR对扩展青霉脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变，构建了R182K与随机突变体ep8叠加突变的重组质粒pA0815-ep8-R182K。将该质粒电转化引入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，进行异源表达。实验结果表明：该叠加突变体在毕赤酵母中获得了活性表达，得到表达产物脂肪酶PEL-ep8-R182K。在最适作用温度下，其比活为 1461.3 U/mg，分别比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS(1407.07 U/mg)和野生型脂肪酶PEL-GS(1281.5 U/mg)提高了3.86％、14.03％。叠加突变脂肪酶PEL-ep8-R182K-GS的最适作用温度为40℃，与野生型脂肪酶PEL-GS和随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS的一致；其Tm值为38.71℃，与野生型脂肪酶PEL-GS(38.81℃)的相似，比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS(40.96℃)下降了2.25℃。

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摘要

中文文摘

第1章绪 论

1.1课题背景

1.2脂肪酶的催化性质

1.2.1脂肪酶催化机理

1.3脂肪酶的研究技术

1.3.1脂肪酶的纯化方法

1.3.2脂肪酶的浓缩方法

1.3.3酶蛋白印迹方法

1.3.4脂肪酶的定向改造

1.4脂肪酶的应用

1.4.1脂肪酶在洗涤剂工业上的应用

1.4.2脂肪酶在食品工业上的应用

1.4.3脂肪酶在造纸工业上的应用

1.4.4脂肪酶在有机合成工业上的应用

1.4.5脂肪酶在油类合成方面的应用

1.4.6其它方面的应用

第2章罗伦隐球酵母胞外脂肪酶的分离纯化及特性分析

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法与步骤

2.2结果与分析

2.2.1 C.laurentii B40培养基优化

2.2.2C.laurentii B40脂肪酶的分离纯化

2.2.3C.laurentii B40脂肪酶N端序列分析

2.2.4C.laurentii B40脂肪酶的最适作用pH及pH稳定性

2.2.5C.laurentii B40脂肪酶的最适作用温度及热稳定性

2.2.6C.laurentii B40脂肪酶的底物特异性

2.2.7各种金属离子及表面活性剂对脂肪酶活性的影响

第3章扩展青霉脂肪酶ep8与R182K叠加突变体的构建

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法与步骤

3.2结果与分析

3.2.1叠加突变获得目的基因

3.2.2获得叠加突变体重组克隆质粒pSK-ep8-R182K

3.2.3获得叠加突变体重组表达质粒pA0815-ep8-R182K

3.2.4叠加突变体pAO815-ep8-R182K阳性转化子的筛选

3.2.5叠加突变体PEL-ep8-R182K-GS的发酵及表达产物的鉴定

3.2.6叠加突变体PEL-ep8-R182K-GS表达产物的特性研究

第4章讨 论

4.1罗伦隐球酵母B40胞外脂肪酶的分离纯化及特性分析

4.1.1发酵培养基对罗伦隐球酵母产酶的影响

4.1.2罗伦隐球酵母B40脂肪酶的分离纯化

4.1.3罗伦隐球酵母B40脂肪酶的酶学特性

4.2扩展青霉脂肪酶ep8与R182K叠加突变体的构建

4.2.1叠加突变提高了扩展青霉脂肪酶的活性

4.2.2叠加突变使扩展青霉脂肪酶稳定性降低

结 论

附 录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致 谢

个人简历