一种用于表达罗伦隐球酵母Rho1GTP蛋白的酿酒酵母基因工程菌、其构建方法及其应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种用于表达罗伦隐球酵母Rho1 GTP蛋白的酿酒酵母基因工程菌、其构建方法及其应用。一种用于表达罗伦隐球酵母rho1 GTP蛋白的酿酒酵母基因工程菌，其含有如SEQ ID NO：3所述的rho1基因cDNA序列。本发明将罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)rho1基因cDNA序列连接到pYES6/CT质粒载体上，并将重组载体转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中进行高效的表达，实现了rho1基因过表达对于酿酒酵母抗逆性和生防效力的提高作用。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种用于表达罗伦隐球酵母Rho1GTP蛋白的 酿酒酵母基因工程菌、其构建方法及其应用。

背景技术

在我国果实采后病害引起的损失率约为20％至50％，每年造成的经济损失高达百 亿水平。为了减少对于环境污染、提高食品安全，生物防治被视为最有可能取代化学杀 菌剂的方法。但在实际农业生产中，生防制剂往往会受到采前和采后不可避免的一种或 多种环境胁迫的影响，如温度胁迫(包括高温和低温)、氧化胁迫、渗透压胁迫和紫外 线的影响。罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)是一种球形真菌，被广泛研究的用于 防治果实采后病害的拮抗酵母。但在NCBI上对于罗伦隐球酵母基因序列主要为核糖体 RNA,而其全基因组序列尚未公布,因此测定转录组序列信息将有助于加快罗伦隐球酵 母分子水平上的研究。

酵母细胞壁完整性(Cellwallintegrity,CWI)信号通路是在细胞正常生长过程中或 者外界环境迅速改变的条件下为应对细胞壁逆境而产生的应答反应。CWI信号通路是 通过细胞表面感受器将逆境信号传导到Rho1GTP酶，而后控制下游的效应因子做成相 应地应答。Rho1GTP酶是CWI信号途径的主调节因子，不仅能整合来自细胞表面的逆 境信号，而且涉及肌动蛋白的重排、细胞完整性的维持、细胞壁的形成等多条重要的代 谢途径。目前，在酿酒酵母中已鉴定出Rhol下游控制的6个效应因子，包括Pkc1蛋白 激酶，β-1,3-葡聚糖合成酶(β-1,3-glucansynthase，β-1,6-GS)、β-1,6-葡聚糖合成酶 (β-1,6-GS)、2个形成素(formin)蛋白(Bni1和Bnr1)、1个泡外复合体组分(Sec3) 和1个转录因子Skn7。

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为一种模式生物，也是第一个用于外源基因 表达的真核生物，具有安全无毒、能对蛋白质进行加工和修饰、遗传背景清楚等优点。 pYES6/CT是一种酵母附加型载体，含有酿酒酵母2μ质粒复制起点有关的部分序列， 作为穿梭载体能够存在于大肠杆菌和酿酒酵母细胞，并能在酿酒酵母染色体之外复制。 启动子是外源蛋白表达盒中的核心构件。GAL1基因作为强启动子能够诱导外源蛋白达 到较高水平的表达，转录水平可以通过葡萄糖抑制，被半乳糖所诱导。在大肠杆菌中以 氨苄青霉素为筛选标记，在酿酒酵母中以杀稻瘟菌素为筛选标记，YEP型载体即使缺 乏选择压力，质粒丢失的速度大概也只为每代3％。

发明内容

本发明提供一用于表达罗伦隐球酵母Rho1GTP蛋白的酿酒酵母基因工程菌。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种罗伦隐球酵母rho1基因cDNA序列，cDNA全长597bp，罗伦隐球酵母rho1 基因cDNA序列为：

ATGTCCGGCGAAATCAGACGAAAGCTCGTTATCGTTGGTGACGGTGCGTGCGGAA AGACATGTCTTCTCATCGTCTTCAGCAAGGGCATGTTCCCCGAGGTCTACGTCCCC ACCGTCTTCGAGAACTACGTTGCCGACGTGGAGGTCGACGGCAAGAAAGTCGAG TTGGCCTTGTGGGATACCGCCGGACAAGAGGATTACGATCGTCTCCGACCTCTGTC TTACCCGGACTCGCACGTCATCCTGATCTGTTTCGCCATTGACTCGCCTGATTCGCT CGATAACGTTCAAGAAAAGTGGATCTCTGAGGTTCTCCACTTCTGCCAAGGACTA CCCATCATCCTCGTCGCCTGCAAAAAGGATCTCCGAGACGACCCAAAGACCATCC AAGACCTCGACAGGATGGGCCAGCACCCTGTCCGTCGAGACGAGGGTTTGGCCG TCGCTCAAAAGATCGGCGCGCAGGGATACGTCGAGTGTTCCGCCAAGACCAACG AGGGTGTCAAAGAGGTCTTCCAAACCGCTACCAGGCACGCTTTGCAGAGCAAGA AGTCGGGCCGATCCAAGCGCTCCGGAAAGGGCGGCTGTGTTGTTCTCTAG(SEQID NO：3)。

一种所述罗伦隐球酵母rho1基因cDNA序列编码的蛋白，其氨基酸序列为：

MSGEIRRKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKGMFPEVYVPTVFENYVADVEVDGKKVELA LWDTAGQEDYDRLRPLSYPDSHVILICFAIDSPDSLDNVQEKWISEVLHFCQGLPIILVA CKKDLRDDPKTIQDLDRMGQHPVRRDEGLAVAQKIGAQGYVECSAKTNEGVKEVFQ TATRHALQSKKSGRSKRSGKGGCVVL(SEQIDNO：4)。

一种用于表达罗伦隐球酵母rho1GTP蛋白的酿酒酵母基因工程菌，其含有如SEQ IDNO：3所述的rho1基因cDNA序列。

一种所述的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，该方法包括如下步骤：

a、将权利要求1所述的rho1基因cDNA序列连接到质粒载体上得到重组载体；

b、将重组载体转入酿酒酵母感受态细胞，在筛选培养基上筛选阳性克隆，测序鉴定后 得到重组酿酒酵母，即所述的酿酒酵母基因工程菌。

作为优选，筛选培养基是含有杀稻瘟菌素的YEPD培养基，其中杀稻瘟菌素的含 量为大于150μg/ml。

作为优选，所述质粒载体为pYES6/CT质粒。

作为优选，步骤a中用于所述的rho1基因cDNA序列的扩增引物为：

URS+rho1-F:5＇-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGTCCGGCGAAATCAGACG-3＇ (SEQIDNO：1)，

DRS+rho1-R:5＇-GAAGGGCCCTCTAGACTCGAGGAGAACAACACAGCCGCCCT-3＇ (SEQIDNO：2)。

一种所述酿酒酵母基因工程菌在梨果实青霉病害防治中的应用。

本发明将罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)rho1基因cDNA序列连接到 pYES6/CT质粒载体上，并将重组载体转化到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中 进行高效的表达，实现了rho1基因过表达对于酿酒酵母抗逆性和生防效力的提高作用。

本发明首先在未知物种基因组序列前提下，通过高通量转录组技术分析，首次获得 罗伦隐球酵母rho1基因cDNA序列；其次通过转化一个与生防酵母细胞壁CWI信号通 路相关，自身没有直接抑菌作用的rho1酶，明确rho1基因过表达对于酿酒酵母抗逆性 和生防效力的提高作用。

本发明提供一种自身能够过表达Rho1GTP酶的酿酒酵母基因工程菌，由于rho1 蛋白是细胞壁完整性信号通路主要调节因子，其在酵母细胞壁合成和逆境适应中起着重 要的作用，通过表达载体高效表达rho1基因，从而增强CWI信号通路转录效率增强对 于逆境的适应力。

本发明的有益效果是：本发明通过对于罗伦隐球酵母进行转录组高通量测序分析找 到其rho1基因的cDNA序列全长，利用高效的DNA定向克隆技术将rho1基因准确连 接到pYES6/CT质粒载体上得到重组载体。通过电转化技术将重组载体转入酿酒酵母感 受态细胞，在筛选培养基上筛选阳性克隆，测序鉴定后得到重组酿酒酵母。

在得到重组酿酒酵母后向培养基内添加半乳糖诱导重组酵母高效表达rho1蛋白。 在37℃高温条件下重组型酵母存活率比野生型酵母高35％，在0％～8％NaCl培养条件 下观察酵母生长动态，表明在高渗透压逆境条件下，重组酿酒酵母SC-rho1在生长动态 和活力方面均优于野生型酵母。将重组酵母用于梨果实青霉病害防治中，发现重组酵母 SC-rho1在高温逆境胁迫下，对于梨果实青霉病害抑制效果优于野生型酵母，在浓度为 10⁶cells/ml时能将发病率降低33％；重组酵母SC-rho1在高渗透压培养条件下，菌液浓 度为10⁵cells/ml～10⁶cells/ml时，重组酵母的生防效力明显高于野生型酵母。

附图说明

图1是罗伦隐球酵母rho1基因扩增电泳图，

图2是半乳糖培养基诱导重组酵母rho1基因表达数据，

图3是不同温度处理对酿酒酵母存活率影响对照图，

图4是0％-1％NaCl对酵母生长动态影响曲线，

图5是2％-8％NaCl对酵母生长动态影响曲线，

图6是高温逆境条件下酿酒酵母对梨果实青霉病害抑制发病率对照，

图7是渗透压逆境下酿酒酵母对青霉病害抑制发病率对照。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将 落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等 均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域 的常规方法。

实施例1：罗伦隐球酵母rho1基因cDNA序列获取

将罗伦隐球酵母菌活化培养后完成转录组序列测定。根据注解(annotation)找到 rho1基因Unigene序列，对打分值较高的Unigene的序列进行分析，并将结果登陆NCBI 进行Blast比较得到罗伦隐球酵母rho1基因cDNA序列。利用DNAman8软件对比目前 NCBI上公布新型隐球酵母与罗伦隐球酵母rho1基因序列。

实施例2：基因工程菌的构建

(1)rho1基因cDNA扩增：提取罗伦隐球酵母总RNA，通过反转录合成cDNA序 列，用Primer6.0软件设计引物如下，横线部分表示在正反向引物5＇端分别引入上游 重组序列URS和下游重组序列DRS：

URS+rho1-F:5＇-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGTCCGGCGAAATCAGACG-3＇ (SEQIDNO：1)，

DRS+rho1-R:5＇-GAAGGGCCCTCTAGACTCGAGGAGAACAACACAGCCGCCCT-3＇ (SEQIDNO：2)，

以cDNA为模板，扩增rho1基因。PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：95℃预变性30s，95℃预变性30s，60℃复性30s，72℃延 伸1min。重复步骤2循环30次。72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产 物，对产物进行切胶回收(图1)。获得全长为597bp的rho1基因cDNA序列。

(2)重组质粒pYES6/CT-rho1构建。

将质粒pYES6/CT用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切线性化克隆载体，于冰浴中配制如 下反应体系：

体系配制完成后，用移液枪吹打混匀组分。置于37℃反应30min。反应完成后立 刻将反应管置于冰浴中冷却5min，之后反应产物转入大肠杆菌感受态细胞中，含有100 μg/ml氨苄青霉素筛选得到转化子，酶切验证后再对质粒进行大量抽提。抽提后得到重 组质粒pYES6/CT-rho1。

(3)重组酵母构建

将重组质粒pYES6/CT-rho1用电转化方法转入酿酒酵母中，取50～200μl菌液涂布 在含有杀稻瘟菌素的YEPD培养基(150μg/ml),27℃倒置培养2～4天直到长出单菌 落。挑取转化子SC-rho1进行菌落PCR验证，以酿酒酵母和罗伦隐球酵母作为阳性对 照，将重组酵母命名为SC-rho1，用50％甘油保存冻结至-80℃冰箱中。将重组酵母接 种至半乳糖诱导液体培养基中，在经过12h、24h、36h诱导后用荧光实时定量PCR 测定rho1基因表达水平，基因表达量均为对照的2倍以上为显著表达(图2)。

实施例3：重组酵母抗逆性评价

(1)温度梯度对于重组酵母存活率影响

吸取1ml野生型和重组型酵母菌液接种至新的培养基中，分别在27℃、33℃、 37℃、42℃下摇床150rpm培养8h。，以27℃条件下培养酵母菌落数为空白对照计 算酵母存活率。每个处理重复3次，每个重复3个平板。试验结果以2次试验数据一致 为准。酵母存活率＝高温培养酵母菌落数/正常培养酵母菌落数。当培养温度达到37℃ 时，重组酵母的存活率为55％，显著高于野生型酵母20％(图3)。

(2)渗透压梯度对重组酵母生长动态影响

吸取1ml野生型和重组型酵母菌液接种至含有0％、0.5％、1％、2％、4％、6％和 8％的NaCl培养基中,27℃下150rpm培养测定菌液OD600。

在0％～1％NaCl培养基条件下野生型酿酒酵母和重组型酿酒酵母SC-rho1生长动态 曲线没有显著性差异(图4)，在2％～6％NaCl培养基条件重组酿酒酵母比野生型酵母更 加快速进入对数期，随着NaCl浓度的升高野生型酵母进入对数期时间由4h延长到24 h(图5)。在对数期的生长速率重组酿酒酵母明显高于野生型酵母，表现出在逆境环境 下的适应能力。

实施例4：重组酵母生防效力评价

(1)温度逆境条件下重组酵母生防效力。

用消毒过的打孔器在梨果实表面形成直径5mm和深度5mm的伤口。在伤口加入 30μl以下试剂(1)无菌水(作为空白对照)；(2)10⁵～10⁸cells/ml正常培养野生型酵 母；(3)10⁵～10⁸cells/ml37℃培养野生型酵母；(4)10⁵～10⁸cells/ml27℃培养重组 型酵母；(5)10⁵～10⁸cells/ml37℃培养重组型酵母，在室温下自然风干后，接入30μl 浓度为10⁴spores/ml的扩展青霉(penicilliumexpansum)菌悬液。将处理后的果实用PE 塑料膜包裹后，置于相对湿度为90％的恒温贮藏室，48h后观察梨果实伤口的发病率。 当重组酵母菌液浓度达到10⁶cells/ml时，重组酵母SC-rho1处理发病率分别为55％和 66％，低于野生型酵母处理的83％和100％。当重组酵母菌液浓度达到10⁷cells/ml时， 重组酵母SC-rho1处理发病率分别为16％和41％，均低于野生型酵母处理(图6)。

(2)渗透压条件下重组酵母生防效力

分别在0％、1％、2％、4％、6％和8％的NaCl培养基中摇床150rpm培养24h。用 消毒过的打孔器在梨果实表面形成直径5mm和深度5mm的伤口。在伤口加入30μl 以下试剂(1)无菌水(作为空白对照)；(2)10⁵～10⁸cells/ml野生型酵母(0％的NaCl 培养基培养)；(3)10⁵～10⁸cells/ml野生型酵母(1％的NaCl培养基培养)；(4)10⁵～10⁸cells/ml野生型酵母(2％的NaCl培养基培养)；(5)10⁵～10⁸cells/ml野生型酵母(4％ 的NaCl培养基培养)；(6)10⁵～10⁸cells/ml野生型酵母(6％的NaCl培养基培养)；(7) 10⁵～10⁸cells/ml野生型酵母(8％的NaCl培养基培养)；(8)10⁵～10⁸cells/ml重组型酵 母(0％的NaCl培养基培养)；(9)10⁵～10⁸cells/ml重组型酵母(1％的NaCl培养基培 养)；(10)10⁵～10⁸cells/ml重组型酵母(2％的NaCl培养基培养)；(11)10⁵～10⁸cells/ml 重组型酵母(4％的NaCl培养基培养)；(12)10⁵～10⁸cells/ml重组型酵母(6％的NaCl 培养基培养)；(13)10⁵～10⁸cells/ml重组型酵母(8％的NaCl培养基培养)；在室温下 自然风干后，接入30μl浓度为10⁴spores/ml的扩展青霉(penicilliumexpansum)菌悬 液。将处理后的果实用PE塑料膜包裹后，置于相对湿度为90％的恒温贮藏室。在含2％ NaCl培养基条件下，野生型酵母在浓度为10⁵cells/ml～10⁶cells/ml时没有生防效力，重 组酵母SC-rho1在各个浓度下的生防效力优于野生型酵母。在含4％～6％NaCl培养基条 件下，野生型酵母的生长活力已经受到明显影响，需要当酵母浓度达到10⁸cells/ml时 可以有效地控制青霉病害，而重组酵母在各个菌液浓度可以降低发病率(图7)。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限 制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。