重组人白细胞介素4在大肠杆菌中的表达、发酵与纯化

摘要

本课题通过对人IL-4基因的优化并选用高效表达载体，比较重组蛋白rhIL-4包涵体表达、分泌型表达和可溶胞内表达，筛选并获得了高水平的表达菌株；通过控制发酵条件，达到了较高的rhIL-4表达率；在此基础上对包涵体形式表达的rhIL-4纯化方法进行了大量的摸索和研究，建立了较佳的纯化路线，得到了高纯度、高得率的rhIL-4蛋白。 1.IL-4基因的优化设计以及大肠杆菌表达根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成人白细胞介素4基因。构建了三种表达菌株，分别是包涵体表达型BL21(DE3)/pET30a(+)/rhIL-4，分泌表达型TOP10/pBAD/gIII/rhIL-4和可溶胞内表达型TOP10/pBAD/rhIL-4，比较并筛选高效稳定表达菌株，最终选择以表达水平较高且表达稳定的包涵体表达型菌株BL21(DE3)/pET30a(+)/rhIL-4作为工程菌。 2.工程菌的发酵培养通过优化发酵培养基、控制诱导OD<,600>、诱导时间等发酵条件，5L发酵罐培养工程菌，发酵液OD<,600>为5.0时诱导3.5h收集菌体，最终菌体密度OD<,600>达11.16，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40％以上，单位体积重组蛋白的表达量达200mg/L发酵液。 3.重组蛋白的规模纯化和鉴定建立了对包涵体形式表达的rhIL-4纯化方法。收集的菌体经压榨破菌获得包涵体，通过包涵体变性、层析、透析复性等方法对rhIL-4进行纯化。每升发酵液可获得40 mg重组蛋白，纯度大于98％，回收率为20％以上。N端氨基酸序列测定结果与理论一致；免疫印迹法检测诱导表达的重组蛋白和纯化的蛋白为IL-4。

目录

论文说明：英文缩略词中英文对照表

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摘要

中文文摘

第1章绪论

1.1基因工程药物的研究现状及发展前景

1.2 IL-4的生物学功能

1.3 IL-4的分子结构和理化特性

1.4重组人IL-4基因工程研究进展

1.3.1原核表达系统

1.3.2酵母表达系统

1.3.3哺乳动物细胞表达系统

1.3.4其它表达系统

1.5本研究的主要内容和意义

第2章IL-4基因的优化设计与表达工程菌的构建

2.1材料

2.1.1菌种和载体

2.1.2主要试剂

2.1.3仪器和设备

2.1.4培养基和缓冲液

2.2方法

2.2.1 IL-4基因的优化设计与全基因合成

2.2.2包涵体表达型工程菌的构建和表达

2.2.3分泌型表达工程菌的构建和表达

2.2.4胞内可溶表达型工程菌的构建和表达

2.2.5高效稳定表达工程菌的筛选

2.3结果

2.3.1优化后的IL-4基因序列

2.3.2包涵体表达型工程菌的构建和表达

2.3.3分泌型表达工程菌的构建和表达

2.3.4胞内可溶表达型工程菌的构建和表达

2.3.5高效稳定表达工程菌的筛选

2.4讨论

2.4.1 IL-4基因的优化设计与表达量的关系

2.4.2表达载体及宿主的选择

2.4.3高效稳定表达工程菌的筛选和获得

第3章表达工程菌的发酵培养

3.1材料

3.1.1菌株

3.1.2设备和仪器

3.1.3培养基与主要溶液

3.2方法

3.2.1种子液的制备

3.2.2工程菌的5L发酵罐培养

3.3结果

3.4讨论

第4章rhIL-4蛋白的规模分离纯化和鉴定

4.1材料

4.1.1菌体本

4.1.2材料

4.1.3仪器和设备

4.2方法

4.2.1 rhIL-4分离纯化简要流程

4.2.2 rhIL-4的分离纯化

4.2.4重组蛋白的N端序列测定

4.2.5重组蛋白的免疫印迹法检测

4.3结果

4.3.1纯化过程目的蛋白的检测

4.3.2 N端测序结果

4.3.3 rhIL-4免疫印迹检测结果

4.4讨论

结论和今后工作设想

附录

参考文献

个人简历及攻读学位期间科研成果

致谢