一个水稻胚乳特异表达基因的筛选及初步分析

摘要

在已有的启动子捕获体系的基础上，我们构建了无启动子的T-DNA插入捕获载体pGUSA-1300。将该载体通过农杆菌介导的方法转化籼稻品种明恢86(Oryzasativa.Indica.Minghui86)，构建籼稻启动子捕获系突变体库，对其中2653个T0代独立启动子捕获系的根、茎、叶、花、胚和胚乳等组织进行β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase，gus)染色检测，获得了61个GUS活性表现的启动子捕获系，其中胚乳中特异表达的有20个。 w9101是一个T0及T1代GUS组织化学检测均表现胚乳特异表达的启动子捕获系，其T0、T1代自交后代标记基因分离分析及Southern blot分析表明它是一个单T-DNA插入的启动子捕获系；通过TAIL-PCR获得其T-DNA插入的侧翼序列，并在NCBI上对其侧翼序列进行比对，发现该启动子捕获系T-DNA插入位点位于一个推测的寡肽转运子基因(暂命名为Peptide Transorter9101，PTR9101)启动子内；w9101不同发育时期不同组织RT-PCR检测表明，PTR9101为胚乳特异性表达基因；生物信息学分析表明PTR9101蛋白整条肽链表现疏水性，其跨膜区域和CHL1(The Nitrate TransporterAtNRT1.1)相似有11个α-螺旋跨膜区，因此推测PTR9101是一个寡肽转运子基因。水稻胚乳由一群高度特化的细胞组成，结合PTR9101基因家族已报道的功能，由此推测PTR9101基因可能与寡肽运输有关。 基于候选基因信息和上游调控序列，结合PLANTCARE软件分析，我们分别构建了PTR9101的cDNA正义表达载体Gt1 PTR9101—1300、PTR9101上游启动子区与GUS报告基因融合的表达载体PTR9101P-GUS，以期进一步了解它们的表达特征及其生物学功能。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

一、 课题背景

1、水稻胚乳研究进展

2、基因捕获技术

二、PTR家族蛋白的研究进展

1、.ATP-bindingcassette transporters(ABC family)

2、Peptide Transporter family(PTR family)

3、Oligopeptide Transporter family(OPT family)

三、本课题的研究内容及技术路线

第一章水稻特异表达启动子捕获系的筛选

1.1前言

1.2材料与方法

1.2.1实验材料

1.2.2实验方法

1.3结果与分析

1.3.1突变体植株叶片潮霉素抗性筛选

1.3.2突变体植株PCR检测

1.3.3突变体植株的GUS活性检测

1.4讨论

第二章水稻胚乳特异表达启动子捕获系w9101的初步分析

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1菌株和质粒

2.2.2水稻启动子捕获系的GUS表达活性检测

2.2.3水稻DNA的提取

2.2.4水稻启动子捕获系的Southern blot分子检测

2.2.5水稻胚乳特异表达捕获系侧翼序列扩增及插入位点的验证

2.2.6水稻RNA的提取

2.2.7水稻胚乳特异表达捕获系候选基因RT-PCR

2.2.8水稻胚乳特异表达捕获系候选基因生物信息学分析

2.3结果与分析

2.3.1胚乳表达GUS活性捕获植株的筛选及遗传分析

2.3.2启动子捕获系w9101侧翼序列扩增及插入位点验证

2.3.3水稻RNA的提取及检测

2.3.4 PTR9101基因的表达特征分析

2.3.5 PTR9101基因上游调控序列的生物信息学分析

2.3.6候选基因PTR9101氮基酸序列基本理化性质分析及序列保守性比对分析

2.4讨论

2.4.1水稻胚乳分子生物学研究的意义

2.4.2水稻肽转运蛋白研究意义

第三章肽转运蛋白PTR9101基因及其启动子功能分析

3.1材料与方法

3.1.1供试水稻品种

3.1.2菌株和质粒

3.1.3 PCR引物合成

3.1.4水稻DNA的提取

3.1.5 PTR9101基因、启动子P1、P2的分离

3.1.6 PTR9101基因、启动子P1、P2中间载体构建

3.1.7 PTR9101基因、启动子P1、P2表达载体构建

3.1.8农杆菌介导获得PTR9101基因及其启动子P1、P2的转基因水稻植株

3.2结果及分析

3.2.1.PTR9101基因及其启动子P1、P2的克隆及其克隆载体的酶切鉴定

3.2.2.PTR9101基因、启动子P1、P2扩增序列的测序鉴定

3.2.3中间载体的酶切鉴定

3.2.4表达载体的酶切鉴定

3.2.5表达载体电击转化农杆菌

3.2.6农杆菌介导获得PTR9101基因及其启动子P1、P2的转基因水稻植株

3.3讨论

第四章 结论

参考文献

附录

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历