黄粉虫体内脂类抗菌活性物质及凝集素的研究

摘要

试验分别用五种不同有机溶剂：丙酮、石油醚、无水乙醇、苯、乙酸乙酯对黄粉虫幼虫和成虫匀浆物进行浸泡提取，选用大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subilis)、普通变形杆菌(Proteas valgaris)、黄曲霉(Aspergillus lfavas)、黑曲霉(Aspergillus nige)作为指示菌，采用圆形纸片扩散抑菌法检测上述各提取物对6种指示菌的抗菌活性，结果表明乙酸乙酯提取物的抗菌效果最好，对6种指示菌均表现了很强的抗菌作用，以后试验选用乙酸乙酯作为黄粉虫体内脂类抗菌活性物质的提取剂。 选用乙酸乙酯对黄粉虫幼虫和成虫匀浆物进行浸泡提取，利用圆形纸片扩散抑菌法，分别检测幼虫和成虫脂类粗提物对11种常见细菌的抗菌活性，结果表明：黄粉虫幼虫和成虫提取物粗品对11种细菌均有显著抑菌效果，但对同一种菌来说，两种粗提物的抑制效果不同，而且同一提取物对不同菌的敏感性也不同。 黄粉虫幼虫和成虫粗提取物经硅胶(100-200目)柱层析后，分离出三种不同极性洗脱组份：无极性组份(石油醚洗脱组份)、弱极性组份(苯洗脱组份)、强极性组份(乙醇洗脱组份)。抗菌活性检测结果显示，幼虫和成虫的石油醚、苯洗脱组份对11种供试细菌均无抑菌作用；而两种乙醇洗脱组份对11种供试菌都表现了很强的抑菌效果。 分别将黄粉虫幼虫和成虫脂类粗提物、乙醇洗脱组份进行最低抑菌浓度MIC(Minimun inhibitory concentration)试验，结果表明：幼虫和成虫乙醇洗脱组份对各种菌的MIC值与粗提物相比，明显降低。 利用以下两种展层剂：幼虫(石油醚：丙酮=3:2)、成虫(石油醚:乙酸乙酯=3:1)对黄粉虫幼虫和成虫乙醇洗脱组份进行薄层层析，分别得到四个条带。将收集的各条带用乙醇溶解，进行抗菌试验，结果显示幼虫乙醇洗脱组份薄层层析得到的四个条带中，Rf0.62的抗菌活性最强；成虫乙醇洗脱组分薄层层析得到的四个条带中Rt0.625的抗菌活性较之其它条带较强。分别将这两条活性较强的条带样品经气相色谱-质谱法(GC-MS)分析其化学成分，结果显示幼虫和成虫抗菌活性较强条带的化学成分有所不同：幼虫活性较强条带的化学成分主要是肉豆蔻酸，成虫活性较强条带的化学成分主要是(E)-9-十八碳烯酸。 采用生长速率法检测幼虫和成虫粗提物对黄曲霉、玉米大斑病病菌(Helminthosporiu)、稻瘟病病菌(Piricularia oryzae)、黑曲霉的抑菌活性，结果显示两种粗提物对四种受试真菌都具有很强的抑制效果，这一发现将为开发新的抗真菌药物提供重要来源。 黄粉虫幼虫和成虫三种不同极性组分对4种受试真菌菌丝生长的影响结果显示幼虫和成虫三种不同极性洗脱组份对四种菌都表现了一定的抑制作用，但抑制效果不同，乙醇洗脱组分对各种菌的抑制效果最好。 黄粉虫幼虫和成虫脂类薄层层析各条带对4种真菌的相对抑制率结果显示，各条带对4种真菌都具有一定的抑制效应，其中幼虫的Rf0.475和成虫的Rf0.337对四种真菌菌丝生长速率的抑制效应明显强于其它条带，抑制率都在30％以上。 分别将这两条抗真菌活性较强的条带样品经气相色谱-质谱(GC-MS)法进行化学成分分析，结果显示当保留时间为3.740min，幼虫条带Rf0.475样品有一个较大的峰，它代表相对含量较高的甘油(76.56％)；当保留时间为23.756 min时，成虫条带Rf0.337样品有一个较大的峰，它代表相对含量较高的甘油单油酸酯(80％)。幼虫和成虫体内抗真菌物质主要成分和含量的不同，可能正是造成抗真菌活性差异的主要原因。 黄粉虫幼虫、蛹、成虫三种虫态的凝集素对11种红细胞的凝集效价结果显示，幼虫、蛹、成虫三种虫态的凝集素对不同红细胞的凝集效应不同，蛹凝集素的凝集效应最弱，成虫凝集素的凝集效应最强。三种虫态的凝集素对兔血红细胞都表现了较高的凝集效应，以后试验中均以2％家兔红细胞作为指示细胞。 分别对黄粉虫幼虫、蛹、成虫三个虫态的凝集素的理化性质进行测定：pH敏感性试验结果显示，三种虫态的凝集素都具有很强的耐酸性；热敏感性试验结果显示，三种虫态的凝集素都对热较敏感，80℃以上时三种虫态的凝集素均失去凝集活性；5种不同浓度的金属离子对黄粉虫三种虫态的凝集素凝集效应的影响结果显示，Zn2+、Cu2+能明显提高三种凝集素的凝集活力，尤其是Cu2+的激活作用更强；L-鼠李糖与果糖溶液对3种虫态的凝集素的凝集活性表现了较强的抑制作用。 采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose(Fast Flow)离子交换层析、SephacrylS-200-HR凝胶过滤层析对黄粉虫幼虫凝集素进行纯化，SDS-PAGE显示为明显的单一条带，亚基分子量约为76KDa；采用Sephacryl S-200-HR凝胶过滤层析法测得其表观分子量为238KDa，说明黄粉虫凝集素为多聚体，是由76KDa的亚基聚合成分子量为278KDa的蛋白。 用紫外分光光度法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白为对照，测得黄粉虫凝集素样品中蛋白浓度为2.4 ug/ul。蒽酮-硫酸法检测黄粉虫幼虫凝集素样品中中性糖含量为53.25ug/ml。 采用日立835氨基酸自动分析仪测定氨基酸组分，除色氨酸水解被破坏未测出外，黄粉虫幼虫凝集素可测出17种氨基酸，其中含量最高的为谷氨酸，其次为天门冬氨酸和亮氨酸，分别占氨基酸总数的11.87％和9.256％，含量最少的为甲硫(蛋)氨酸和组氨酸，分别占氨基酸总数的1.61％和1.81％。 用UV2201型紫外分光光度计对黄粉虫幼虫凝集素溶液进行240-320nm的波长扫描，以蒸馏水为空白对照，取样间隔为1nm，测得黄粉虫幼虫凝集素紫外吸收光谱的最大吸收峰在265nm。 本研究以黄粉虫为材料，使用有机溶剂提取体内的脂类物质，进行体外抗菌活性试验，研究抗菌物质对常见的细菌和动植物病原菌的抑制作用，并利用气相色谱-质谱(GC-MS)法进行化学成分分析，以此来了解其抗菌作用机理，为寻找抗生素替代品寻找新的材料来源。其次通过对黄粉虫幼虫、蛹、成虫三种虫态的凝集素凝集红细胞的特性及理化性质的研究，揭示其凝集反应发生的机理。并从黄粉虫幼虫中分离纯化出凝集素，对其进行了较为详细的性质分析，这些都为以后对黄粉虫体内凝集素的开发利用提供了理论资料。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

一、昆虫免疫的研究进展及应用前景

1、细胞免疫

2、体液免疫

3、昆虫体内免疫物质的诱导

4、昆虫免疫应用前景

二、黄粉虫研究进展

1、黄粉虫简介

2、黄粉虫营养价值评定及开发利用

3、黄粉虫化学防御系统的研究进展

4、黄粉虫免疫酶的研究进展

5、黄粉虫体内甲壳素和壳聚糖的研究进展

6、黄粉虫抗菌肽研究进展

三、本研究的目的和意义

第一章黄粉虫脂类抗菌活性物质的研究

1.1前言

1.2材料和方法

1.2.1材料

1.2.2试验方法

1.3试验结果与分析

1.3.1不同溶剂提取物筛选的结果

1.3.2黄粉虫幼虫和成虫脂类物质抗细菌活性测定及化学成分分析

1.3.3黄粉虫幼虫和成虫脂类提取物抗真菌活性测定及化学成分分析

1.4讨论

1.4.1脂类抗菌物质的广谱抗菌性

1.4.2提取剂对提取物抗菌效果的影响

1.4.3柱层析纯化对抗菌效果的影响及原因分析

1.4.4黄粉虫幼虫和成虫抗菌活性物质化学成分的差异

1.4.5黄粉虫幼虫和成虫抗真菌活性物质化学成分的差异

第二章黄粉虫凝集素的分离纯化及理化性质

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1试验材料

2.2.2试验方法

2.3结果与分析

2.3.1黄粉虫幼虫、蛹、成虫提取液样品中蛋白质含量测定

2.3.2动物红细胞凝集作用

2.3.3黄粉虫三种虫态的凝集素理化性质研究

2.3.4黄粉虫凝集素的分离纯化及部分理化性质检测

2.4讨论

2.4.1黄粉虫三个虫态的凝集素对不同类型红细胞的凝集

2.4.2有关黄粉虫三个虫态的凝集素理化性质的探讨

2.4.3 凝集素的分离纯化

第三章结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历