Burkholderia sp.ZYB002产脂肪酶条件优化及脂肪酶基因克隆

摘要

筛选到一株对有机溶剂有较高耐受性的产脂肪酶菌株Burkholderia sp.ZYB002，利用响应面法优化了产酶发酵条件；克隆得到了其脂肪酶基因和伴侣蛋白基因，并对二者进行了生物信息学分析。主要研究内容及结果如下： (1)以罗丹明B为指示剂筛选产脂肪酶菌株，其中ZYB002发酵酶活最高，在30％(V/V)的苯中仍可生长。该菌株对氨苄青霉素、卡那霉素、四环素具有天然的抗性，而对氯霉素敏感。16S rDNA序列分析表明该菌株与Burkholderia cenocepacia同源。其脂肪酶在70℃酶活最高，该酶在pH6.0～pH9.0保持稳定，Cu2+和Zn2+抑制其活性，而Ca2+则有一定的激活作用。 (2)单因子实验确定最适碳源、氮源、诱导剂、发酵周期、培养温度等。添加Triton X-100可提高产酶量。Plackett-Burrman设计筛选出对产酶影响最大的3个因素；设计爬坡实验逼近了最大产酶区；进行响应面中心组合设计对这三个因素进行优化。发现双水相萃取方法提取脂肪酶的效果优于硫酸铵沉淀。 (3)PCR扩增得到脂肪酶基因(lip)和伴侣蛋白基因(lif)。二者与Burkholderiacepacia相应基因均具有很高同源性。Lip蛋白N端存在信号肽序列。Lif蛋白N端存在跨膜疏水区；含有脂肪酶伴侣蛋白超家族保守区域。以DNAstar分析了二者的二级结构分布情况，以SWISS-MODEL分析了二者的三级结构。 微生物脂肪酶是一类重要的工业酶，种类多、来源广、生产周期短、pH和作用温度范围广、对底物具有专一性，具有较高的催化活性和稳定性，可在有机相中进行催化反应。其中假单胞菌脂肪酶具有高立体选择性、底物专一性、位置选择性和较高的转酯活性，广泛应用于洗涤工业、食品加工、药物合成、手性拆分、生物能源等各个领域，是理论和应用研究的热点。 筛选优良的产脂肪酶的假单胞菌菌株是一项重要且必须的基础性工作。罗丹明B是一种筛选脂肪酶产生菌的有效指示剂，不受pH值的制约。本研究从筛选脂肪酶产生菌着手，利用油脂同化平板进行筛选，得到了细菌11株、真菌20株。摇瓶复筛以ZYB002菌株活性最高，以之为进一步研究对象。该菌株生长曲线具有典型的细菌生长特征；对氨苄青霉素、卡那霉素、四环素具有天然的抗性，对氯霉素敏感；在30％(V/V)的苯中仍可生长，具有较高的有机耐受性。以PCR方法扩增获得ZYB002菌株的16S rDNA序列。将该序列进行同源性检索，结果表明该菌株16S rDNA基因与Burkholderia cenocepacia具有99％同源性。采用NJ法构建系统进化树，结果表明与Burkholderia cenocepacia进化关系最为密切，定名为Burkholderia sp.ZYB002。 不同条件下检测酶活发现，ZYB002菌株所产脂肪酶在70℃时出现最高酶活力。该酶在pH6.0～pH9.0之间具有良好的稳定性，酶活均保持在93％以上。Cu2+和Zn2+对其酶活性具有极大的抑制作用，而Ca2+则有一定的激活作用。 为了获得较高的脂肪酶产量，本研究对Burkholderia sp.ZYB002进行了发酵优化。通过培养基单因子实验确定了糊精、牛肉膏、大豆油分别为最适碳源、氮源、诱导剂。大豆油可以增加其mRNA总量，而使产酶量增加。发现培养基中添加TritonX-100可提高产酶量。通过培养条件单因子实验确定了发酵周期为22小时，培养温度为30℃，装液量60ml，添加玻璃珠10颗，摇瓶覆盖6～8层纱布。ZYB002菌株的发酵产酶温度以不高于30℃为宜，不同于大肠杆菌等其它细菌的发酵温度。ZYB002菌株对溶解氧的要求虽不十分严格，但仍宜控制溶氧水平使产酶达到最大。通过Plackett-Burrman设计从7个因素中，筛选出对产酶影响最大的3个因素，分别为大豆油乳化液、K2HPO4和起始pH，进而通过爬坡实验逼近了最大产酶区。利用SAS软件对3个因素进行响应面中心组合设计并构建模型。响应面优化得到的结果为：糊精0.3％(W/V)，牛肉膏2.0％(W/V)，MgSo4.7H2O0.075％(W/V)，K2HPO40.14％(W/V)，大豆油乳化液4.89％(V/V)，pH 8.11，接种量2.0％(V/V)。验证实验发酵液最高酶活达45.6 U/mL，提高了3.44倍 摇瓶发酵条件下，ZYB002菌株产酶与发酵液pH呈负相关，酶活力达到最大时，发酵液pH值降至最低。进行放大实验时应控制发酵液pH。在发酵24小时之前，菌浓与酶活同步增长，24小时之后，菌浓上升酶活下降。发酵液中存在蛋白酶，其酶活力与脂肪酶同步变化，且发酵后期下降慢，宜采取措施控制蛋白酶活性。 通过硫酸铵分级沉淀提取ZYB002脂肪酶，纯化倍数仅为1.63倍，且损失较大。通过双水相萃取提取可纯化3.10倍，不仅损失小，且收率得到了提高，比活也得到显著提高。可知双水相萃取提取脂肪酶的效果明显优于硫酸铵沉淀。 通过对Burkholderia全基因组序列和已得到功能验证的序列进行必对，在保守区域设计引物，优化PCR条件，克隆到Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶基因及伴侣蛋白基因。菌株ZYB002脂肪酶基因(lip)、伴侣蛋白基因(lif)分别与Burkholderia cepacia脂肪酶基因、伴侣蛋白基因具有很高同源性。氨基酸序列的同源性分析说明，Lip蛋白、Lif白与Burkholderia cepacia同源性仍然很高，但Lif与Burkholderia属其它种的同源性则较低，与其它属的同源性则更低。两个蛋白中均存在特征性保守序列。 预测显示Lip蛋白N端存在信号肽序列，中间序列存在丝氨酸活性位点，结构域预测显示该脂肪酶含有水解酶结构域。疏水性分析显示，Lif蛋白的N端显示了较高的疏水性，并且存在跨膜区；结构域预测发现含有脂肪酶伴侣蛋白超家族保守区域。以DNAstar和SWISS-MODEL分别模拟得到了二者的二级结构和三级结构，与已解析三维结构的脂肪酶和伴侣蛋白相似性均较高。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1微生物脂肪酶资源及筛选

1.1.1微生物脂肪酶资源

1.1.2有机溶剂耐受性微生物脂肪酶资源

1.1.3微生物脂肪酶的资源采集和筛选

1.2脂肪酶的发酵和提取

1.2.1影响脂肪酶发酵产量的因素

1.2.2发酵条件的优化策略

1.2.3脂肪酶的分离提取

1.3微生物脂肪酶的性质

1.3.1微生物脂肪酶的酶学性质

1.3.2微生物脂肪酶的催化特点

1.3.3微生物脂肪酶的结构特点

1.4脂肪酶的应用

1.4.1食品工业

1.4.2药物开发

1.4.3洗涤剂行业

1.4.4生物柴油

1.4.5皮革加工

1.4.6环境治理

1.4.7造纸工业

1.5本课题研究的目的和意义

第2章脂肪酶产生菌的筛选和鉴定

2.1前言

2.2材料

2.2.1土样

2.2.2培养基

2.2.3溶液与试剂

2.2.4主要仪器

2.3方法

2.3.1脂肪酶活力测定

2.3.2产脂肪酶菌株筛选

2.3.3菌株特性检测

2.3.4 16S rDNA分子生物学鉴定

2.3.5不同条件下检测脂肪酶活性

2.4结果与讨论

2.4.1油脂同化平板初筛结果

2.4.2摇瓶复筛结果

2.4.3菌株ZYB002生长曲线

2.4.4菌株ZYB002抗生素抗性检测

2.4.5菌株ZYB002的有机耐受

2.4.6菌株ZYB002的形态学观察

2.4.7菌株ZYB002的分子生物学鉴定

2.4.8不同条件下检测脂肪酶活性

2.5小结

第3章脂肪酶发酵优化及提取

3.1前言

3.2材料

3.2.1菌种

3.2.2培养基

3.2.3溶液与试剂

3.2.4主要仪器

3.3方法

3.3.1脂肪酶活力测定

3.3.2蛋白酶活力测定

3.3.3蛋白含量测定

3.3.4发酵

3.3.5硫酸铵沉淀

3.3.6双水相萃取

3.4结果与讨论

3.4.1最适碳源的选择

3.4.2最适氮源的选择

3.4.3最适诱导剂的选择

3.4.4发酵周期的确定

3.4.5 Plackett-Burrman设计筛选影响产酶主要因素

3.4.6最陡爬坡实验确定主要因素水平中心点

3.4.7响应面实验设计确定主要因素的最优水平

3.4.8培养温度对发酵的影响

3.4.9溶解氧对发酵的影响

3.4.10不同表面活性剂对脂肪酶活性的影响

3.4.11脂肪酶活性与相关指标的变化

3.4.12脂肪酶提取方法的比较

3.5小结

第4章脂肪酶基因克隆及生物信息学分析

4.1前言

4.2材料

4.2.1菌种及质粒

4.2.2酶及相关试剂

4.2.3仪器

4.2.4培养基

4.3方法

4.3.1 ZYB002脂肪酶基因克隆

4.3.2生物信息学分析

4.4结果与讨论

4.4.1目的基因的获得

4.4.2 TA克隆

4.4.3 ZYB002脂肪酶基因的生物信息学分析

4.4.4 ZYB002脂肪酶伴侣蛋白基因的生物信息学分析

4.5小结

结论

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历