扩展青霉脂肪酶“盖子”结构域突变对其活性影响的研究

摘要

为了便于对扩展青霉脂肪酶基因进行分子设计及改造，本论文将扩展青霉脂肪酶成熟肽编码基因插入到pPIC9K表达载体中，构建重组表达质粒pPIC9K-pel，并在脂肪酶基因5’端上游加上（His）6标签的编码序列。通过比对扩展青霉脂肪酶与黑曲霉阿魏酸酯酶的氨基酸序列，选择扩展青霉脂肪酶“盖子”左右侧铰链区的第66、81、94位氨基酸、整个“盖子”以及“盖子”右侧铰链区等五个部位作为突变位点，研究扩展青霉脂肪酶“盖子”结构及其两侧铰链区突变对脂肪酶活性的影响。
　　 利用前面构建的重组表达质粒pPIC9K-pel作为模板，采用环状质粒一步PCR定点突变法对扩展青霉脂肪酶“盖子”左右两侧铰链区的三个氨基酸残基进行突变（T66G、T81P、K94E），获得含有突变氨基酸残基编码序列的重组表达质粒，依次为：pPIC9K-pel-T66G、pPIC9K-pel-T81P、pPIC9K-pel-K94E。上述重组表达质粒导入到毕赤酵母GS115营养缺陷型菌株，甲醇诱导表达。表达产物经过Ni-柱亲和纯化后，测定其水解4-硝基苯癸月桂酸酯的比活力。实验结果表明：PELT66G重组脂肪酶的比活力与野生型PEL脂肪酶相近，为5.09 U/mg：而PELT81P和PEIK94E重组脂肪酶的比活力比野生型脂肪酶分别提高了2.95倍和2.57倍，分别达到19.1U/mg和17.2 U/mg。
　　 其次采用引入酶切位点再环状质粒回复突变法置换了扩展青霉脂肪酶的“盖子”结构域（68ITDFVND175-71DTNLOLDT78），并与毕赤酵母表达载体pPIC9K构建成重组表达质粒，命名为pPIC9K-pel（-lid）；该重组质粒导入到毕赤酵母GS115营养缺陷型菌株，甲醇诱导表达。表达产物经Ni-柱纯化后，SDS-PAGE电泳能检测到一条约28 kDa的表达条带。表达产物经橄榄油罗丹明B平板定性检测没有酶活。
　　 最后通过重叠延伸PCR置换了扩展青霉脂肪酶的“盖子”右侧铰链区（76DIA78-79NYT81），突变体插入到载体pPIC9K构建成重组表达质粒，命名为pPIC9K-pel-76DIA78-79NYT81。该重组质粒导入到毕赤酵母GS115营养缺陷型菌株，甲醇诱导表达。表达产物经橄榄油罗丹明B平板定性检测没有酶活。
　　 上述实验结果表明：扩展青霉脂肪酶的“盖子”结构域对其活性有着极为重要的影响，其中“盖子”、“盖子”右侧铰链区以及T81P和K94E的突变表现得尤为明显，这些位置的突变，导致脂肪酶活性完全丧失或者整倍地提高。

目录

文摘

英文文摘

中文文摘

绪论

第一节 脂肪酶概述

1.1 脂肪酶的来源及研究热点

1.2 脂肪酶的定义及与酯酶的区别

1.3 微生物脂肪酶的结构及分泌

1.4 脂肪酶催化特性

1.5 脂肪酶的应用

第二节 微生物脂肪酶的蛋白质工程策略

2.1 前言

2.2 脂肪酶化学修饰

2.3 基因水平上的蛋白质进化

2.4 分子进化需要解决的问题

2.5 展望

第三节 课题的研究背景、内容、意义和创新点

3.1 课题研究背景

3.2 课题的研究意义

3.3 课题研究的创新点

第一章 扩展青霉脂肪酶的异源真核表达

第一节 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

第二节 结果与分析

2.1 扩展青霉脂肪酶基因的扩增

2.2 重组表达质粒的构建与验证

2.3 pPIC9K-pel电转化毕赤酵母GS115

2.4 整合了pel基因的转化子发酵上清液酶活的定性检测

第三节 小结与讨论

第二章 扩展青霉脂肪酶“盖子”结构域两侧铰链区的定点突变

第一节 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

第二节 结果与分析

2.1 确定环状质粒一步突变PCR的最佳反应体系

2.2 环状质粒一步定点突变pel基因

2.3 菌液PCR验证含突变重组质粒的转化子

2.4 突变的重组质粒电转化毕赤酵母GS115

2.5 含突变基因的转化子发酵液上清的酶活定性检测

2.6 纯化的脂肪酶酶活定性检测

2.7 纯化产物的SDS-PAGE检测

2.8 纯化的蛋白质浓度测定

2.9 纯化的蛋白质pNPL比色法测定酶活

第三节 小结与讨论

第三章 扩展青霉脂肪酶“盖子”结构域置换

第一节 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

第二节 结果与分析

2.1“盖子”置换的扩展青霉脂肪酶融合基因的获得

2.2 完整片段的TA克隆

2.3 插入完整片段的T载体的回复突变

2.4 置换了盖子的重组表达质粒的构建与验证

2.5 pPIc9K-pel(-lud)质粒电转化毕赤酵母GS115

2.6 换盖重组转化子酶活的定性检测

2.7 SDS-PAGE检测换盖重组脂肪酶的纯化

第三节 小结与讨论

第四章 扩展青霉脂肪酶“盖子”右侧铰链区的置换

第一节 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

第二节 结果与分析

2.1 置换了盖子右侧铰链区的扩展青霉脂肪酶融合基因的扩增

2.2 置换盖子右侧铰链区的重组表达质粒的构建及验证

2.3 pPIC9K-pel-76DIA78-79NYT81质粒电转化毕赤酵母GS115

2.4 重组转化子酶活的定性检测

第三节 小结与讨论

第五章 结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢