黑曲霉脂肪酶盖子结构域突变对其活性影响的研究

摘要

黑曲霉脂肪酶（Aspergillus niger lipase，ANL）是一类广泛应用于油脂加工、食品添加剂和洗涤剂添加剂等工业领域，具有良好生物安全性的生物催化剂。本论文以本课题组保藏的、分离自新疆火山口的脂肪酶高产菌株黑曲霉FJNU01菌株为出发材料，克隆其脂肪酶基因。通过比较黑曲霉脂肪酶盖子结构及其两侧铰链区的氨基酸残基序列与黑曲霉阿魏酸酯酶（A.niger feruloyl esterase，ANE）对应区域的氨基酸残基序列的差异，确定突变位点，构建了一系列脂肪酶突变体。
　　 利用重叠延伸PCR方法，对黑曲霉脂肪酶盖子结构两侧铰链区上的氨基酸残基进行定点突变，获得了anl-S84G、anl-D99P、anl-K108E三个突变脂肪酶基因；将组成脂肪酶整个α-螺旋盖子结构的氨基酸残基序列替换成阿魏酸酯酶对应结构域的氨基酸残基序列，获得了脂肪酶突变基因anl-anelid；将组成脂肪酶盖子结构左右两侧铰链区的氨基酸残基序列替换成阿魏酸酯酶对应区域的氨基酸残基序列，获得了脂肪酶突变基因anl-lidLR。
　　 将分子改造后的脂肪酶突变基因插入到pPIC9K质粒中，构建系列重组表达载体；重组表达载体经SacⅠ线性化后导入到巴斯德毕赤酵母GS115，筛选得到重组转化子。重组转化子经甲醇诱导表达，离心收集发酵上清液，然后用碱性滴定法测定重组脂肪酶突变体酶活。实验结果表明：GS-pPIC9K-anl-D99P和GS-pPIC9K-anl-K108E重组子发酵上清液的脂肪酶酶活分别为21.37U/mL和16.30U/mL，相对野生型脂肪酶分别为85.48％和65.20％，而GS-pPIC9K-anl-S84G、GS-pPIC9K-anl-anelid和GS-pPIC9K-anl-lidLR的发酵上清液均未检测到脂肪酶活性。用Ni-NTA纯化上述发酵上清液中的重组蛋白，纯化后的蛋白质SDS-PAGE电泳结果表明：ANL-S84G、ANL-D99P、ANL-K108E、ANL-anelid均显示单一条带，而anl-lidLR未能纯化出来。

目录

文摘

英文文摘

中文文摘

绪论

1.微生物脂肪酶的研究进展

1.1 简介

1.2 微生物脂肪酶分子的结构特征

1.3 微生物脂肪酶的应用

1.4 微生物脂肪酶资源的开发

1.5 微生物脂肪酶的催化机制

2.微生物脂肪酶分子进化

2.1 理性设计

2.2 定向进化

3.本课题研究背景、意义及技术路线

3.1 课题背景

3.2 研究意义

3.3 技术路线

第一章 黑曲霉脂肪酶基因的定点突变

1.材料与方法

1.1 菌种与质粒

1.2 工具酶

1.3 试剂与溶液

1.4 常用培养基与缓冲液

1.5 寡聚核苷酸引物

1.6 黑曲霉脂肪酶基因的制备

1.7 突变基因的获得

1.8 重组质粒的构建

1.9 重组质粒的转化及筛选

1.10 脂肪酶突变基因的DNA测序

2.结果与分析

2.1 突变基因的获得

2.2 重组质粒的构建

2.3 大肠杆菌重组转化子的验证筛选

2.4 脂肪酶突变基因序列分析

3.本章讨论

第二章 黑曲霉脂肪酶基因的片段置换

1.材料与方法

1.1 菌种与质粒

1.2 工具酶

1.3 试剂与溶液

1.4 常用培养基与缓冲液

1.5 寡聚核苷酸引物

1.6 黑曲霉脂肪酶基因的制备

1.7 突变基因的获得

1.8 重组质粒的构建

1.9 重组质粒的转化及筛选

1.10 脂肪酶突变基因的DNA测序

2.结果与分析

2.1 突变基因的获得

2.2 重组质粒的构建

2.3 大肠杆菌重组转化子的验证筛选

2.4 脂肪酶突变基因的序列分析

3.本章讨论

第三章 脂肪酶突变基因的表达与纯化

1.材料与方法

1.1 菌种与质粒

1.2 工具酶

1.3 试剂与溶液

1.4 常用培养基与缓冲液

1.5 重组表达质粒的大量制备

1.6 重组表达载体的线性化

1.7 重组表达载体转化毕赤酵母GS115

1.8 毕赤酵母转化子的筛选

1.9 突变基因在毕赤酵母GS115中诱导表达

1.10 突变脂肪酶的纯化

1.11 脂肪酶活性检测

2.结果与分析

2.1 重组表达载体的线性化

2.2 重组表达质粒的电转及筛选

2.3 突变脂肪酶基因的诱导表达及分析

2.4 突变脂肪酶纯化产物分析

3.本章讨论

第四章 结论

附录1 本课题技术流程图

附录2 英文缩略词表

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历