酿酒酵母HOR2基因缺失突变株的构建及其生物学性质研究

摘要

工业革命以来，世界经济的发展离不开能源的发展，化石燃料一直是能源供应的主流、经济发展的支撑点。但是，随着科学技术的发展、工业的进步以及人口的膨胀，对能源的需求越来越紧迫。但是由于这些化石燃料属于不可再生燃料，在不同程度上都会对环境造成污染和破坏，因而找到一种可再生的燃料将是关键。生物作为可再生能源开发的媒介尤为重要，其中以可再生的燃料乙醇凸显。作为传统真核模式生物菌的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是典型的乙醇产生菌，现已被广泛的用于生物乙醇的实验研究和发酵生产。
　　 甘油是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）乙醇代谢的主要副产物之一。酿酒酵母中含有两个基因（HOR2，RHR2）编码与甘油代谢相关的3-磷酸甘油酯酶系。其中，HOR2为渗透压调节型，在高渗透压的条件下有较大量的表达；而RHR2则为厌氧调节型，在缺氧的条件下有较多量的表达。因此，通过敲除HOR2或者RHR2（本研究选择敲除HOR2）基因在一定条件下可以阻断或者部分的阻断甘油代谢，从而减少甘油的产生，最终使更多的碳源用于转化生成乙醇，为酿酒酵母代谢调控打下一定的基础。
　　 本论文通过设计含有与HOR2（GPP2）基因两侧序列同源的长引物，以质粒PUG6为模板进行PCR构建含有Cre/loxP系统的酿酒酵母HOR2基因敲除组件，转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS2，获得为loxP-kan-loxP序列组件所替换而产生kanr的阳性克隆子。然后再将质粒pSH65转入阳性克隆子诱导表达Cre酶切除筛选标记，在原ORF基因处保留一个loxP位点，丢失质粒后获得HOR2单倍体缺陷型菌株。重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除。从而成功的获得了酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株，并命名为YS2-HOR2。发酵实验表明，突变株甘油产量降低3.34％，乙醇产量提高1.96％。

目录

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中文文摘

绪论

1 研究背景

1.1 生物质能概念及其分类

1.2 燃料乙醇的优点及其发展方向

1.3 酿酒酵母是传统的乙醇代谢菌株

2 酿酒酵母育种方法的发展情况

2.1 常规育种

2.2 原生质体融合育种

2.3 分子育种

3 基因敲除技术

3.1 基因插入突变

3.2 RNA干扰

3.3 基因同源重组

3.4 基因敲除技术展望

43-磷酸甘油脱氢酶和3-磷酸甘油酯酶对甘油代谢的影响

4.13-磷酸甘油脱氢酶

4.23-磷酸甘油酯酶

5 本研究目的意义

第一章 材料与方法

第一节 实验材料

1.1.1 菌种与质粒

1.1.2 培养基

1.1.3 寡聚核苷酸引物

1.1.4 酶和试剂

1.1.5 主要仪器

1.1.6 试剂与溶液的配制

第二节 实验方法

1.2.1 Cre/LoxP系统

1.2.2 酵母YS2基因组DNA的提取

1.2.3 聚合酶链式反应(PCR)

1.2.4 通过菌落PCR来验证酵母菌落

1.2.5 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备

1.2.6 质粒pUG6与pSH65的转化

1.2.7 碱裂解法制取pUG6及pSH65质粒DNA

1.2.8 UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA

1.2.9 乙醇沉淀DNA

1.2.10 平板影印法

1.2.11 LiAc/SS载体DNA/PEG化学高效转化法

1.2.12 突变株生理特性的实验

1.2.13 突变株乙醇代谢的发酵测定实验

1.2.14 突变株发酵甘油的测定

第二章 结果与讨论

第一节 实验结果

2.1.1 酵母出发菌(YS2)基因组DNA的提取

2.1.2 酵母YS2的HOR2基因的存在性验证

2.1.3 质粒pUG6、pSH65的扩增及鉴定

2.1.4 构建HOR2基因敲除组件

2.1.5 HOR2基因的敲除

2.1.6 YS2-HOR2突变株生理特性试验

2.1.7 突变株发酵液甘油和乙醇产量的测定

第二节 讨论

第三章 结论

附录1 波美度、糖度、比重换算表

附录2 主要符号对照表

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致 谢

个人简历