龙眼胚胎乙醇脱氢酶的分离纯化、鉴定及其cDNA克隆

摘要

在龙眼离体胚胎发生中发现存在某种类型的脱氢酶，初步的研究显示该组蛋白质可能是NAD依赖型的类糖醇脱氢酶。比较了该类糖醇脱氢酶在龙眼离体胚胎发生过程中的变化，发现随着胚发育进程，其活性逐步降低;同工酶电泳显示，虽然其酶谱各谱带均出现于胚性愈伤组织、球形胚和子叶胚中，但随着胚的发育其染色强度不断降低，显示龙眼离体培养材料存在的该组酶与其离体胚的发生、发育有关。为了明确该组类糖醇脱氢酶的属性，以揭示其在龙眼胚胎发生、发育过程中的生理作用，本试验进行了该酶的分离、纯化、生物质谱鉴定及其cDNA克隆。主要研究结果如下： 1.龙眼胚性愈伤组织类糖醇脱氢酶的分离纯化。采用低浓度的DTT以及加入10％的甘油有利于该组类糖醇脱氢酶在体外溶液环境的稳定。在此基础上，通过研究其在不同层析分离介质中的分离特性，建立了适用于该组类糖醇脱氢酶的分离纯化体系。经过80％饱和度的(NH4)2SO4盐析、SephadexG-25柱脱盐，然后经过DEAE-SepharoseF.F.、DEAE-52、PhenylSepharose和Superdex200柱层析，从龙眼胚性愈伤组织中分离纯化得到类糖醇脱氢酶的2个同工酶组分Lc.A和Lc.B。比较非变性PAGE和SDS-PAGE的结果，显示Lc.A和Lc.B均为同型二体蛋白，其亚基的表观分子量大小相同，为47.4kD。Lc.A和Lc.B具不同的等电点。 2.龙眼胚性愈伤组织类糖醇脱氢酶的生物质谱鉴定。应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行肽质量指纹分析，显示Lc.A和Lc.B均能较好地与其他植物的乙醇脱氢酶(ADH)相匹配。应用电喷雾解离—四极杆—飞行时间串连质谱(ESI-Q-TOF2)技术解析了Lc.B的4个胰酶水解肽段的氨基酸序列，分别是：GTFFGNYKPR、KFGVTEFVNPK、AFEYMLGGDGR和FITHEVPFSEINK；解析了Lc.A的4个胰酶水解肽段的氨基酸序列，分别是：FGVTEFVNPK、GTFFGNYKPR、FITHEVPFSEINK和DYDKPVQEVIAEMTDGGVDR(或者DYDKPVKEVLAEMTDNVDR)。数据库检索和序列比对分析均表明Lc.A和Lc.B均显著匹配于ADH。因此，在肽质量指纹的基础上，鉴定从龙眼胚性愈伤组织中纯化得到的类糖醇脱氢酶Lc.A和Lc.B分别为ADH同工酶的2个组分。 3.龙眼离体胚胎发生、发育过程中ADH的活性变化测定。试验发现，从胚性愈伤组织至球形胚和子叶胚阶段，ADH的活性呈下降趋势，同工酶谱分析进一步显示了相同的结果，表明高ADH活性可能与龙眼的体胚早期发生或与维持愈伤组织的高再生能力有关。 4.龙眼胚性愈伤组织ADHcDNA克隆。采用同源克隆的方法获得了龙眼ADHcDNA的保守片段，并在此基础上，通过3'和5'-RACE，获得了龙眼ADH的cDNA全序列，该序列与其他植物ADHcDNA有很高的同源性。该cDNA全长1386bp，包含一个1140bp的开放阅读框，编码380个氨基酸。在推导的氨基酸序列中，发现其存在乙醇脱氢酶酶活性催化中心的锌(Zn)结合位点和结构性Zn结合位点。分析其阅读框架发现，串联质谱获得的Lc.A和Lc.B的肽片段序列均分别包含在其推导的氨基酸序列中，从而认为龙眼中的乙醇脱氢酶Lc.A和Lc.B可能为该cDNA的编码产物；将该cDNA的开放阅读框克隆到表达载体pET-15b中，并在大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中获得了融合表达。 5.龙眼合子胚ADHcDNA的克隆。从龙眼合子胚幼胚中提取得到总RNA，采用RT-PCR的方法，克隆得到ADHcDNA的开放阅读框，测序的结果显示该序列与离体胚中获得cDNA相一致。初步表明该Adh基因表达于龙眼的体胚和合子胚的发生、发育过程。 此外，研究还发现龙眼胚性愈伤组织中的乙醇脱氢酶Lc.A和Lc.B在分离纯化的过程中亦能表现出无底物脱氢酶(nothingdehydrogenase)的活性，文中就其生化特性及其与龙眼胚发生的关系进行了讨论。

目录

文摘

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引言

第一章龙眼离体胚中类糖醇脱氢酶分离纯化方法的建立

第二章龙眼类糖醇脱氢酶Lc.A和Lc.B的分离纯化

第三章Lc.A和Lc.B的质谱鉴定及其在龙眼体胚发生中活性变化的再证实

第四章龙眼胚性愈伤组织ADH cDNA的克隆及原核表达

总结

参考文献

附录

致谢

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