乳胶凝集试验、间接ELISA诊断鸭病毒性肝炎方法的建立

摘要

鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的雏鸭的一种急性高度致死性传染病，以发病急、传播迅速、病程短和高死亡率为主要特点。其病原主要是由I型DHV所引起，呈世界性分布，在我国首次报道于1963年。本病在全国各地都有发生，是严重危害养鸭业的主要疾病之一。随着养鸭业的迅速发展，该病发病率一直居高不下。据统计，DVH的发生率和死亡率均在65％以上，给养鸭业造成了巨大的经济损失。所以，对该病尽早做出诊断以便更好的预防和治疗成为控制本病的关键。因此，临床上建立一种切实可行且快速的诊断方法越来越受到国内水禽养殖业的关注。本研究以此为出发点，建立了快速、简便、准确，而且能够在基层应用的间接ELISA检测病毒抗体和乳胶凝集试验检测病毒抗原抗体两种血清学诊断方法。 本课题以本实验室分离鉴定保存的鸭肝炎病毒VFY变异株为研究材料，开展了鸭肝炎病毒病间接ELISA和乳胶凝集试验两种血清学诊断方法的研究与应用工作。 1.分离株病毒经反复冻融离心后氯仿处理，再经Sephadex G-200分子筛层析提纯制备了所需的诊断抗原，病毒蛋白含量为6.2357mg/mL。 　　2.用鸡胚传代毒VFY-70按所设定的免疫程序免疫健康成年公番鸭，获得琼扩效价为1:16的阳性血清，经粗提和纯化获得了蛋白含量为4.6573mg/mL，的IgG。同时采集健康番鸭的血清，纯化后获得了蛋白含量为3.3mg/mL的番鸭IgG，按所设定的免疫程序免疫家兔，获得琼扩效价为1:8的兔抗番鸭二抗血清，并纯化得到蛋白含量为8.0068mg/mL的二抗IgG。采用改良过碘酸钠法成功地把HRP标记在纯化的二抗IgG上，结果表明，酶结合率=0.8384，标记率=0.7464，符合ELISA的要求。 3.用纯化的抗鸭肝炎病毒抗体致敏乳胶成功地建立了反向乳胶凝集试验检测鸭肝炎病毒抗原的方法。通过试验，确定了抗体致敏乳胶的最佳浓度为0.4657mg/mL，最佳致敏温度为37℃，最佳致敏时间为2h。应用研究结果表明，抗体致敏乳胶无自凝性，特异性强，重复性好，质量可靠。 4.利用竞争凝集的原理，采用纯化的抗鸭肝炎病毒抗体致敏乳胶与待测血清抗体竞争结合最小抗原量，建立了竞争乳胶凝集试验检测病毒抗体的方法，此法对抗原纯度要求不是很高，避开了DHV难纯化这一难题。试验结果表明，最小抗原量为1:320即0.01949mg/mL。应用研究结果表明，该法不与其它病原发生交叉反应，阻断效果明显，检测鸭肝炎病毒抗体可达1:800，比琼扩试验高50倍，测定临床采集的血清阳性率达62.5％，琼扩试验阳性率37.5％，两者符合率75％，批内批间重复结果稳定。因此，竞争乳胶凝集法检测鸭肝炎病毒抗体特异性高、敏感性强、重复性好、质量稳定、结果可靠，适合于临床流行病学调查。 5.用纯化的鸭肝炎病毒作为包被抗原和HRP酶标记的兔抗番鸭二抗，成功地建立了检测鸭肝炎病毒病抗体的间接ELISA法。试验结果表明，包被抗原浓度为10μg/mL，待检血清1:25稀释，酶标二抗1:800稀释，是本方法最佳的工作浓度。应用研究结果表明，该法不与其它病原发生交叉反应，阻断效果明显，检测鸭肝炎病毒抗体可达1:800比琼扩试验高50倍，ELISA测定临床采集的血清阳性率达70％，琼扩试验阳性率37.5％，两者符合率67.5％，批内批间重复结果稳定。因此，间接ELISA法检测鸭肝炎病毒抗体特异性高、敏感性强、重复性好、质量稳定、结果可靠，适合于临床流行病学调查。

目录

声明

摘要

前言

综述

一、鸭病毒性肝炎概述

1历史和分布

2流行病学

3发病机理

4临床症状

5病理变化

6血清学诊断

二、鸭肝炎病毒概述

1 I型DHV

2 Ⅱ型DHV

3 Ⅲ型DHV

三、乳胶凝集试验的研究进展

1凝集试验原理

2乳胶凝集试验原理

3乳胶致敏技术的研究现状

实验一 抗原与抗体的制备及二抗酶标

1材料

2方法

2.1抗原的制备

2.2抗体的制备

2.3二抗(兔抗番鸭)的酶标

3结果

3.1病毒感染力的测定

3.2病毒纯化

3.3抗体制备

实验二 反向乳胶凝集试验检测鸭肝炎病病毒抗原方法的建立

1材料

2方法

2.1乳胶的预处理

2.2抗体致敏乳胶条件的选择

2.3致敏乳胶质量检验

2.4对比试验

2.5人工感染试验

3结果

3.1抗体致敏乳最佳条件选择

3.2致敏乳胶质量检验

3.3对比试验

3.4人工感染试验

3.5乳胶凝集试验操作程序

实验三 竞争乳胶凝集试验检测鸭肝炎病毒抗体方法的建立

1材料

2方法

2.1抗原最小反应量的确定

2.2敏感性试验

2.3特异性试验

2.4重复试验

2.5结果判定标准

3 结果

3.1抗原最小反应量的确定

3.2敏感性试验

3.3特异性试验

3.4重复试验

实验四 间接ELISA法检测鸭肝炎病毒抗体方法的建立

1材料

2方法

2.1最佳反应条件的选择

2.2封闭液的选择

2.3临界值的确定

2.4敏感性试验

2.5特异性试验

2.6重复试验

2.7人工感染试验

2.8间接ELISA检测DHV抗体滴度操作方法与结果判定

3 结果

3.1酶标抗体工作浓度的选择(方阵法)

3.2最佳包被抗原浓度与最佳反应血清浓度的选择(方阵法)

3.3封闭液的选择

3.4临界值的确定

3.5敏感性试验

3.6特异性试验

3.7重复试验

3.8人工攻毒雏鸭抗体检测

讨论

1抗原的制备

2抗原的制备

3反向乳胶凝集试验

4竞争乳胶凝集试验

5关于间接ELISA

结论

参考文献

附录

致谢