油菜花粉超微粉有效成分溶出、代谢特征及指纹图谱研究

摘要

油菜花粉是一种丰富的花粉资源，具有提高免疫活性、降血脂、抗肿瘤等生物学功能。目前对油菜花粉的研究侧重于基础和应用研究，而对于深入系统的研究较少。本研究以油菜花粉为实验材料，采用超微粉碎技术使花粉破壁，以普通粉碎方式作为对照，对比了两种粉碎方式对所得的超微粉和细粉中主要营养成分、有效成分的影响，及组织形态学上的差异；比较油菜花粉超微粉、细粉中槲皮素和山奈酚在实验动物体内的药代动力学参数；对油菜花粉超微粉多糖进行分级，筛选抗氧化和免疫活性部位，对活性部位多糖进行结构表征；建立油菜花粉超微粉黄酮类成分的HPLC指纹图谱，使这一丰富资源的开发和应用提高到新的水平，主要结果如下： 1.分析比较了超微粉碎和普通粉碎方式对油菜花粉主要营养成分含量的影响，并比较了扫描电镜下超微粉和细粉形态学上的差异。结果表明：除粗纤维含量降低外，粗蛋白、粗脂肪、灰分、还原糖和总黄酮含量都有不同程度的提高。在电镜下观察，油菜花粉细粉基本可以看到完整的细胞形态，而超微粉的颗粒变小、大小均匀，绝大多数细胞壁破裂，基本无完整的细胞存在，破壁率为98.86％ 2.分别采用高效液相色谱法、比色法分析比较了油菜花粉超微粉和细粉中黄酮类成分(槲皮素、山奈酚)、不同浸提时间下多糖的溶出差异。结果表明：在相同的提取条件下，油菜花粉超微粉中槲皮素和山奈酚的溶出率比细粉分别提高了45.16％和27.86％。油菜花粉超微粉多糖的溶出量和溶出速度都大于细粉，浸提时间为10min时多糖的溶出率较细粉提高了202.54％；红外光谱结果显示油菜花粉超微粉和细粉多糖的主要基团无明显差异。超微粉碎可显著提高油菜花粉有效成分的溶出率。 3.采用高效液相色谱法测定家兔灌胃给予油菜花粉超微粉和细粉后血浆中槲皮素和山奈酚的浓度，血药浓度-时间数据经药代动力学分析软件(PKS软件)处理，比较油菜花粉超微粉和细粉中槲皮素和山奈酚在家兔体内的药代动力学参数。结果表明：油菜花粉超微粉和细粉中槲皮素和山奈酚的药代动力学最佳模型均为二室开放模型。油菜花粉超微粉槲皮素的主要药动学参数：Ka=0.5793h-1，t1/2α=2.43h， t1/2β=18.33h， AUC0→∞=0.3613μg·L-1·h，Vd=804.8 L·kg-1， Tpeak=2.5714h，Cmax=0.01908μg·mL-1；油菜花粉细粉槲皮素的主要药动学参数：Ka=1.2790h-1，t1/2α=2，63 h，t1/2β=28.00h， AUC0→∞=0.3411μg·L-1·h， Vd=997.3 L·kg-1， Tpeak=3.048h，Cmax=0.018769μg·mL-1。油菜花粉超微粉山奈酚的主要药动学参数：Ka=0.4136h-1， t1/2α=2.29h， t1/2β=2.97h， AUC0-∞=1.8897μg·L-1·h， Vd=33.056L·kg-1，Tpeak=3.6429h，Cmax=0.28079μg·mL-1；油菜花粉细粉山奈酚的主要药动学参数：Ka=0.44362h-1，t1/2α=1.74 h，t1/2β=1.99h， AUC0→∞=1.4599μg·L-1·h， Vd=31.418L·kg-1，Tpeak=3.7143 h，Cmax=0.24553μg·mL-1。与细粉组比较，油菜花粉超微粉组血浆槲皮素和山奈酚的达峰时间缩短、达峰浓度提高，相对生物利用度较细粉分别提高了46.00％、29.44％。超微粉碎技术可提高油菜花粉有效成分槲皮素和山奈酚的生物利用度。 4.采用不同截留分子量(100kD、50kD和10kD)的超滤膜对油菜花粉超微粉粗多糖进行分级纯化，分析了压力和时间对超滤过程的影响，确定最适操作条件，3种截留分子量的超滤膜运行时间分别控制在28、36和48min以内，操作压力分别为1.1、1.3和1.6MPa。油菜花粉超微粉粗多糖M按分子量分成M1>100kD、50kDM>M1>M3。 5.M2级分多糖先后经DEAE-SephadexA-25离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析纯化得到RPP1-2。经高效液相凝胶色谱鉴定其纯度及计算分子量，RPP1-2为单一对称峰，重均分子量为65358Da。离子色谱测定RPP1-2中-SO42-含量为2.81％。紫外光谱、红外光谱和核磁共振分析结果表明，RPP1-2为糖蛋白缀合物，为α-糖苷键构型，分子结构中存在α-(1，3)、α-(1，6)糖苷键，RPP1-2由3种不同单糖残基组成的杂多糖，糖链中重复单位包含葡萄糖、甘露糖和半乳糖。 6.采用高效液相色谱法对不同产地的油菜花粉超微粉的指纹图谱进行比较，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件对油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC指纹图谱进行分析评价。以芦丁为内标物，采用Diamonsil C18柱(250×4.6mm，5μm)为分析色谱柱，乙腈-0.4％磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，流速0.8mL·min-1，检测波长254 nm，柱温25℃。结果表明：10批不同产地的油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC指纹图谱较相似，各成分得到较好的分离，并根据检测结果确定了10个共有指纹峰。该方法具有重现性好，特征性强，方法简便、快速等特点，能够客观反映油菜花粉超微粉的指纹特征，可以成为油菜花粉超微粉质量评价及控制的表征指标。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1油菜花粉的研究概况

1.1油菜花粉破壁研究

1.2油菜花粉多糖研究进展

1.3油菜花粉黄酮类成分研究进展

1.4油菜花粉的药理作用

1.5花粉在食品加工中的应用

1.6花粉在动物生产中的应用

2超微粉碎技术在食品工业中应用研究进展

2.1超微粉碎技术的概念

2.2超微粉碎技术的特点和分类

2.3超微粉碎技术在食品工业中的应用

3黄酮类化合物药代动力学研究概况

3.1生物样品分析

3.2黄酮类化合物的药动学研究

4指纹图谱研究概况

4.1指纹图谱的定义

4.2指纹图谱的特点和作用

4.3指纹图谱主要研究技术

4.4指纹图谱的研究现状

4.5指纹图谱在食品工业中的应用现状

5本论文的立题依据、研究内容及研究意义

第二章油菜花粉超微粉主要成分分析及组织形态学研究

1材料与仪器

1.1材料

1.2主要仪器

1.3主要试剂

2实验方法

2.1破壁率的检测

2.2主要成分分析

2.3组织形态学研究

3结果与分析

3.1油菜花粉超微粉和细粉主要营养成分分析

3.2总黄酮含量测定结果

3.3油菜花粉超微粉和细粉组织形态学研究

4讨论与结论

第三章 油菜花粉超微粉和细粉中功能性成分——多糖和黄酮类物质的溶出研究

1材料与仪器

1.1材料

1.2主要仪器

1.3主要试剂

2实验方法

2.1油菜花粉超微粉和细粉多糖的溶出研究

2.2油菜花粉超微粉和细粉黄酮类物质的溶出研究

3结果与分析

3.1油菜花粉超微粉和细粉多糖溶出结果

3.2油菜花粉超微粉和细粉黄酮类物质的溶出结果

4讨论与结论

第四章油菜花粉有效成分槲皮素和山奈酚在家兔体内的药代动力学研究

1材料与仪器

1.1材料

1.2药品与试剂

1.3主要仪器

1.4试验动物

2实验方法

2.1给药方案

2.2兔血浆中槲皮素和山奈酚含量测定方法的建立

3结果与分析

3.1血浆中槲皮素、山奈酚测定方法的建立

3.2标准曲线和线性范围

3.3精密度和回收率试验结果

3.4稳定性试验结果

3.5家兔灌胃给予油菜花粉后两组试验动物的平均药物浓度

3.6家兔灌胃给予油菜花粉后槲皮素和山奈酚的药代动力学参数

4讨论与结论

第五章油菜花粉超微粉多糖分级分离、结构鉴定及抗氧化、免疫活性研究

1油菜花粉超微粉多糖分级分离及抗氧化、免疫活性研究

1.1材料与仪器

1.2实验方法

1.3结果与分析

1.4讨论与结论

2油菜花粉超微粉多糖活性级分的结构表征

2.1材料与仪器

2.2实验方法

2.3结果与分析

2.4讨论与结论

第六章油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC指纹图谱的研究

1材料与仪器

1.1材料

1.2主要试剂

1.3主要仪器

2实验方法

2.1色谱条件

2.2内标溶液和供试品溶液的制备

2.3比较超声和回流方式对黄酮类成分的提取效果

2.4比较不同溶剂对黄酮类成分的提取效果

2.5正交优选油菜花粉超微粉黄酮类成分提取工艺

2.6方法学考察

2.7不同产地油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC指纹图谱的建立

2.8相似度评价

3结果与分析

3.1超声和回流方式对黄酮类成分的提取结果

3.2不同溶剂对黄酮类成分的提取结果

3.3正交优选油菜花粉超微粉黄酮类成分提取工艺试验结果

3.4方法学考察结果

3.5不同产地油菜花粉超微粉样品的指纹图谱

3.6共有指纹峰的标定

3.7油菜花粉超微粉黄酮类成分HPLC指纹图谱的建立

3.8相似度评价结果

4讨论与结论

4.1提取溶剂的考察

4.2色谱条件的选择

4.3内标的选定

4.4相似度评价

4.5结论

第七章全文总结

1本研究结论

2本研究创新点

3本研究还需进一步解决的问题

参考文献

致谢