稻瘟病菌两个假定的Rho GTP酶激活蛋白的功能研究

摘要

Rho GTP酶，通过在GTP结合激活态与GDP结合失活态之间的转换，在调控细胞活动中起着分子开关的作用。Rho GTP酶激活蛋白（RhoGAP）作为调控因子，能够激活Rho GTP结合蛋白内在的GTP酶活性，使其加速水解成GDP失活态。在真菌中，RhoGAP参与调控细胞骨架的重组和细胞极性生长，在细胞形态建成中发挥着关键作用。 稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）是研究丝状真菌的重要模式生物。该菌的侵染循环涉及复杂的细胞分化过程，以应对宿主的防卫机制。我们推测RhoGAP在这一过程中起到调控作用。稻瘟病菌数据库分析表明，稻瘟病菌中有8个假定的RhoGAP蛋白，它们均有保守的RhoGAP结构域。本研究对其中两个假定的RhoGAP蛋白MgLrg1和MgRga1进行了功能分析。我们通过同源重组的方法构建了MgLRG1和MgRGA1的敲除突变体。对敲除突变体的表型进行分析后发现：Mglrg1敲除突变体菌丝生长速度明显减慢，菌丝末端分枝增多；分生孢子形态正常，但产孢量显著减少，孢子无法分化出正常的附着胞且丧失了致病性。Mgrga1敲除突变体分生孢子形态异常，产孢量略微下降；在疏水表面上附着胞形成严重滞后，但不影响菌丝的生长发育和致病性。这些结果表明了MgLrg1对于稻瘟病菌的细胞分化、极性生长和侵染致病是必需的；已证实MgRga1与MgCdc42可直接互作，因此MgRga1可能通过调节Cdc42的活性，在细胞极性生长过程中起着重要作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1 Rho GTP酶激活蛋白及其功能的多样性

1.1.1 RhoGAP和Rho族蛋白的关系

1.1.2 RhoGAP的结构

1.1.3 RhoGAP活性的调控机制

1.1.4 RhoGAP的功能多样性

1.2稻瘟病菌研究概况

1.2.1稻瘟病菌的侵染循环过程

1.2.2稻瘟病菌产孢信号途径

1.3稻瘟病菌RhoGAP蛋白的研究意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1供试菌株

2.1.2供试质粒

2.1.3供试植物

2.1.4培养基

2.1.5生化试剂

2.2实验方法

2.2.1蛋白序列获得与分析

2.2.2稻瘟病菌基因组DNA的提取及质量的检测

2.2.3 DNA琼脂糖电泳

2.2.4 PCR扩增

2.2.5 PCR产物的胶回收

2.2.6 PCR产物的TA克隆

2.2.7 Escherichia coli DH5α感受态细胞的制备

2.2.8感受态细胞的转化

2.2.9质粒DNA的提取

2.2.10质粒酶切与连接

2.2.11MgLRGl和MgRGAl敲除载体的构建

2.2.12稻瘟病菌原生质体制备和转化

2.2.13稻瘟病菌菌丝体total RNA的提取及检测

2.2.14 RT-PCR反转录

2.2.15 Southern杂交

2.2.16稻瘟病菌突变体的表型观察

3结果与分析

3.1稻瘟病菌RhoGAP生物信息学分析

3.2稻瘟病菌MgLrgl的结构和功能分析

3.2.1 Mglrgl的结构特点

3.2.2MgLRGl敲除载体的构建

3.2.3Mglrgl敲除突变体的筛选与验证

3.2.4稻瘟病菌Mglrgl敲除突变体的表型分析

3.3稻瘟病菌MgRgal的结构和功能分析

3.3.1 MgRgal的结构特点

3.3.2MgRGAl敲除载体的构建

3.3.3Mgrgal敲除突变体的筛选与验证

3.3.4稻瘟病菌Mgrgal敲除突变体的表型分析

4小结与讨论

4.1 MgLrgl和MgRgal的结构特点

4.2 MgLrgl对于稻瘟病菌菌丝的生长发育、产孢及致病性是必需的

4.3 MgRgal影响了稻瘟病菌分生孢子的形态发育

4.4 RhoGAP在Rho-PAK信号途径中的作用

参考文献

附录

致谢