龙眼胚性愈伤组织限制生长保存及其生理与遗传机理的研究

摘要

龙眼是我们南方重要热带亚热带特产果树。本研究以龙眼胚性培养物为材料，进行龙眼种质资源离体保存研究。试验进行了龙眼胚性愈伤组织(embryogenic callus，EC)限制生长保存条件优化，限制生长保存后龙眼EC的体胚发生与植株再生，龙眼EC限制生长保存过程中可溶性糖、淀粉以及有机酸含量的变化，龙眼EC限制生长保存及体胚发生过程中染色体数目变异以及RAPD分析。主要研究结果如下： 1.龙眼EC限制生长保存条件优化 试验以红核子龙眼EC为供试材料，比较了不同浓度甘露醇、不同浓度肌醇、不同接种量、甘露醇和肌醇交互培养、不同浓度蔗糖、不同浓度琼脂、不同浓度PP333、不同盐浓度以及光质对龙眼EC生长的影响。试验结果表明：在本试验范围内，琼脂、PP333、盐浓度以及光质对龙眼EC限制生长保存影响效果不显著，而添加20g/L甘露醇、0.1 g/L的肌醇，并把接种量控制在0.1g/瓶，龙眼EC的继代周期可延长到70d左右。 2.限制生长保存后龙眼EC的体胚发生与植株再生 试验从保存的52份龙眼EC中，随机抽取了15个(凤梨穗、松风本Ⅱ、鸡蛋本、苗翘、云本、油潭本、福眼、青壳蕉、普明庵、血丝、红核子、公妈本、立冬本、巨龙105、双孖木)离体保存的龙眼EC，对其进行体胚诱导、成熟、植株再生以及体胚苗移栽的研究，以检测离体保存的龙眼EC的体胚发生能力，同时为不同龙眼品种体胚发生提供参考。15个龙眼品种的体胚诱导研究表明：15个龙眼品种、不同蔗糖浓度、有机附加物、生长调节剂、光质对体胚发生的时间、数量以及质量在不同程度上有一定的影响，胚状体在15-35d皆先后形成，多为白色小子叶胚，分化频率为100％，形成数量从2550-13220个/g不等；体胚成熟研究表明：15个龙眼品种、不同蔗糖浓度、有机附加物、光质对胚状体的大小、形态都存在一定的影响，胚状体多白色增大，大小在5-15mm不等；植株再生研究表明：15个龙眼品种、不同成熟时间、不同胚状体、光质对体胚萌发率以及再生苗长势影响显著，多数正常成熟体胚在15d左右就萌发，萌发率从50％-93％不等；体胚苗移栽研究表明体胚苗移栽到沙土(泥炭土：沙子=1：2)基质上，苗成活率可达83.33％。因此，限制生长保存后的15个龙眼品种EC仍保持强烈的体胚发生与植株再生能力。 3.龙眼EC限制生长保存过程中可溶性糖、淀粉以及有机酸含量的变化 试验以限制生长保存的龙眼EC为材料，测定了红核子、松风本、苗翘在4种不同培养基中限制生长保存过程中的可溶性糖、淀粉以及有机酸含量的变化。对不同龙眼品种在不同培养基保存过程中可溶性总糖、淀粉的变化研究表明：龙眼不同基因型以及不同培养基限制生长保存过程中总糖含量变化都有所不同。红核子与苗翘在A、B培养基中，出现积累高峰较C、D培养基早，且红核子在D培养基中、苗翘在C、D培养基中出现3次积累高峰。松风本在A、D培养基中只有1次积累高峰，而在B、C培养基中有两次积累高峰；龙眼同一基因型在不同培养基限制生长保存过程中淀粉含量有所不同，但龙眼EC限制生长保存过程中淀粉与总糖含量变化基本一致。 对不同龙眼品种在不同培养基保存过程中有机酸含量的变化研究表明：龙眼EC在不同培养基限制生长保存过程中有机酸含量总体呈现下降趋势，在培养前期出现有机酸积累高峰有所不同，积累高峰的出现是有机酸的积累达到一个高度，随着培养时间的增加，EC的逐渐衰老，有机酸含量整体呈现下降趋势。 4.龙眼EC限制生长保存及体胚发生过程中染色体数目变异 试验对保存的龙眼EC及其体胚发生过程中染色体数目的变异进行研究，以寻求降低变异的途径。试验结表明：胚性愈伤组织中多倍化细胞占12.4％，二倍体细胞比例为85.0％；球形胚中多倍化细胞占8.4％，二倍体细胞比例为89.4％；子叶胚中多倍化细胞占4.8％，二倍体细胞比例为94.4％；正常苗根尖多倍化细胞占2.8％，二倍体比例为96.6％。结果表明：在胚状体发生过程中，胚状体和植株中变异细胞占的比例低于EC组织中的比例，培养物多倍化细胞较缺体高，二倍体细胞比例逐步增多，表明胚状体和植株再生过程是一个对变异细胞的淘汰过程，在分化中二倍体细胞具有某种选择优势。同时试验中诱导5mo的红核子龙眼EC已经能见到染色体数目异常的细胞，变异率为8.6％，继代3a后，变异率达10.0％，且继代3a的松风本、巨龙105的染色体数目变异率也分别在9.0％、9.8％，继代13a的红核子EC染色体变异率为15.0％。表明龙眼EC的在前期变异水平变化幅度可能较大，但长期继代过程中染色体数目变异逐步趋于稳定。 5.龙眼限制生长保存EC体胚发生过程及再生植株的RAPD分析 利用RAPD技术从DNA分子水平对限制生长保存后的龙眼EC体胚发生过程及其体胚发生再生植株进行遗传稳定性检测。筛选了10条随机引物，对龙眼EC体胚发生过程及其体胚发生再生植株基因组DNA进行扩增。结果表明：龙眼体胚发生过程的RAPD分子标记存在一定的差异，但不同保存年份EC体胚发生过程中的相对变异率都保持在比较小的变异范围内(小于5.1％)；同时利用RAPD-PCR随机检测3个保存时间的红核子胚性培养物的再生完整植株的基因组DNA的差异，PCR扩增产物表明不同保存时间的EC再生植株之间的RAPD分子标记有差异，保存5mo的变异率为9.70％，保存3a的变异率是13.07％，保存13a的变异率是15.07％。说明同一基因型的胚性愈伤组织经长期限制生长保存后体胚再生完整植株的遗传变异频率有趋于稳定的趋势，有利于离体种质保存。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

声明

第一章 引言

1植物种质资源离体保存研究进展

1.1国内外植物种质资源离体保存现状

1.2植物种质资源离体保存方法

1.3植物种质资源离体保存的优点

2植物体胚发生研究进展

2.1体胚发生的主要途径

2.2两种体胚发生途径遗传变异

2.3植物体胚发生过程

2.4影响植物体胚发生的因素

3植物离体保存过程中机理研究进展

3.1细胞学变异机理

3.2分子水平上变异机理

3.3生理变化机理

3.4植物离体保存过程中体细胞无性系变异的检测

4龙眼生物技术研究进展

4.1龙眼胚性愈伤组织的诱导及其体细胞胚胎发生

4.2龙眼组织器官培养

4.3龙眼基因工程研究进展

4.4龙眼种质资源离体保存研究进展

4.5龙眼生物技术中存在的问题

5本研究的主要内容及意义

5.1本研究主要内容

5.2本研究意义

第二章 龙眼EC限制生长保存条件优化

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

1.3培养条件

2结果与分析

2.1龙眼EC延长继代周期

2.2龙眼EC继代过程中生长曲线

3讨论

3.1甘露醇在龙眼EC离体种质保存中的作用

3.2肌醇在龙眼EC离体种质保存中的作用

3.3接种量在龙眼EC离体种质保存中的作用

3.4蔗糖在龙眼EC离体种质保存中的作用

3.5琼脂在龙眼EC离体种质保存中的作用

3.6无机盐在龙眼EC离体种质保存中的作用

3.7 PP333在龙眼EC离体种质保存中的作用

3.8光质在龙眼EC离体种质保存中的作用

第三章 限制生长保存后龙眼EC的体胚发生与植株再生

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

1.3培养条件

1.4移栽基质的筛选

2结果与分析

2.1龙眼EC的体胚诱导

2.2龙眼体胚的成熟

2.3龙眼体胚的萌发与植株再生

2.4不同移栽基质对龙眼体胚苗移栽成活的影响

3讨论

3.1龙眼体胚发生与基因型的关系

3.2龙眼体胚成熟与其萌发的关系

3.3光质在体胚发生与植株再生过程中的作用

3.4龙眼体胚苗移栽成活的关键因素

第四章 龙眼EC限制生长保存过程中生理变化

第一节 龙眼EC限制生长保存过程中可溶性总糖含量的变化

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第二节 龙眼EC限制生长保存过程中淀粉含量的变化

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第三节 龙眼EC限制生长保存过程中有机酸含量的变化

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第五章 龙眼EC限制生长保存及体胚发生过程中染色体数目变异

1材料与方法

1.1材料

1.2染色体数目检测

1.3染色体数目检测方法

2结果与分析

2.1不同继代天数有丝分裂指数的变化

2.2龙眼离体培养物的染色体数目变异

2.3生长调节剂对龙眼EC细胞染色体数目变异的影响

2.4培养时间对龙眼EC细胞染色体数目变异的影响

2.5不同品种对龙眼EC染色体数目变异的影响

3讨论

3.1龙眼EC限制生长保存下的遗传稳定性

3.2龙眼EC染色体数目变异与体胚分化的关系

3.3龙眼体细胞胚胎发生过程中的遗传变异与遗传改良

第六章 龙眼限制生长保存EC体胚发生及再生植株的RAPD分析

第一节 龙眼EC体胚发生过程遗传稳定性的RAPD分析

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第二节 龙眼EC限制生长保存后体胚再生完整植株之间的RAPD分析

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第七章 小结

1龙眼EC限制生长保存条件体系优化

2限制生长保存后龙眼体胚发生与植株再生体系的优化

3龙眼EC限制生长保存过程中可溶性糖、淀粉以及有机酸含量的变化

4龙眼EC限制生长保存及体胚发生过程中染色体数目检测

5龙眼限制生长保存EC体胚发生过程及再生植株的RAPD分析

参考文献

附录、图版及其说明

在学期间发表论文与参加学术活动

致谢