外来入侵生物B型烟粉虱对噻虫嗪的代谢抗性分子机制研究

摘要

B型烟粉虱是一种分布范围广、经济危害性较大的农业害虫。而噻虫嗪是目前防治烟粉虱效果较好的杀虫剂，作为第二代新烟碱类杀虫剂的典型代表，也是第一个硫代烟碱类杀虫剂，因其高效、低毒、安全的特点成为目前防治刺吸类害虫的首选药剂。为了明确烟粉虱对噻虫嗪的抗性机制，本研究利用RT-PCR技术克隆了B型烟粉虱抗性、敏感品系的P450基因CYP6CM1，并进行序列比对分析；利用荧光定量PCR技术对其抗性、敏感品系CYP6CM1基因的mRNA表达量进行了定量分析与比较；对RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术进行了初步研究，本研究的结果如下： (1)成功克隆出B型烟粉虱的P450基因cyp6cm1，其中敏感品系、抗性品系长均为1592bp，含有1563bp的完整的开放阅读框，编码521个氨基酸；抗性品系与敏感品系相比，CYP6CM1基因发生了3个碱基替换，导致2个氨基酸替换，碱基替换的位置分别位于编码区的1048，1357，1377位。氨基酸替换为E350 G、P452T。抗性、敏感品系的cyp6cm1基因的核苷酸相似性为99.81％，氨基酸序列一致性为99.62％。 (2)采用荧光定量PCR技术研究了CYP6CM1基因在抗性、敏感品系中的mRNA表达差异，结果表明CYP6CM1基因在抗性品系中的mRNA表达量比敏感品系高，分别为86.81、23.72，抗性品系的表达量为敏感品系的3.66倍，初步表明噻虫嗪抗性的形成可能与该基因的过量表达有一定的关系。 (3)对RNA干扰体系的建立进行了初步研究。设计了两段CYP6CM1基因片段，一段是位于保守区1185bp-1408bp之间长为223bp的核苷酸序列；另一段是位于非保守区750bp-967bp之间长为218bp的核苷酸序列。通过RT-PCR技术获得了相应的cDNA，即合成dsRNA所需的模板，为进一步进行RNA干扰奠定了基础。

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引言

1.1烟粉虱的抗药性研究进展

1.1.1烟粉虱对杀虫剂的抗性

1.1.2烟粉虱抗药性分子机理研究

1.2细胞色素P450氧化酶的概况

1.2.1 P450的结构

1.2.2细胞色素P450的命名法则

1.2.3P450种类的多样性

1.2.4昆虫CYP6家族的多样性

1.2.5与抗药性有关的P450基因

1.3荧光定量PCR技术

1.3.1基本原理

1.3.2常用的荧光定量技术

1.3.3荧光定量的定量方法

1.3.4荧光定量PCR的优点

1.3.5荧光定量PCR技术的应用

1.4 RNAi技术概况

1.4.1 RNAi的发现

1.4.2 RNAi机制

1.4.3昆虫瞬时dsRNAi(Transient RNAi)的导入方法

1.4.4 RNAi在昆虫应用领域的发展

1.5研究内容和目的

1.5.1研究内容和方法

1.5.2本实验的研究目的和意义

1.5.3技术路线

第二章B型烟粉虱细胞色素P450基因的克隆与序列分析

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2RT-PCR

2.1.3烟粉虱P450基因的克隆

2.2结果与分析

2.2.1烟粉虱RNA的提取

2.2.2烟粉虱CYP6CMI基因的PCR扩增

2.2.3 核酸序列结果及其分析

2.3小结

第三章烟粉虱抗性品系和敏感品系P450基因定量表达的比较

3.1试验材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.2试验方法

3.2结果与分析

3.2.1 RNA的提取

3.2.2目的片段的传统PCR扩增

3.2.3荧光定量PCR条件的优化

3.2.4标准曲线和扩增曲线的建立

3.2.5熔解曲线的建立

3.2.6 cyp6cm1基因表达差异的检测

3.3讨论

第四章RNAi体系的建立

4.1材料与方法

4.1.1试验材料

4.1.2试验方法

第五章全文总结

参考文献

致谢