动物源和水源肠球菌万古霉素耐药表型、基因型检测及同源性研究

摘要

目的：调查动物源(宠物医院、鸡场、猪场)、水源(闽江、小区池塘、学校鱼塘、污水沟、下水道)耐万古霉素肠球菌(Vancomycin resistant enterococcus VRE)的分离率，并对分离出的耐万古霉素肠球菌进行耐药表型、基因型检测及同源性研究，为指导兽医临床合理用药及控制VRE向人类的传播提供依据。 方法：采用琼脂平板筛选法(ADSP法)分离耐万古霉素肠球菌；根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的方法，以微量肉汤稀释法对分离出的30株动物源及17株水源耐万古霉素肠球菌进行常用6种抗菌药物的敏感性检测；用多重PCR的方法同时进行耐药基因及肠球菌种水平的鉴定；用基因外重复回文序列-PCR(Repetitive extragenic palindromic elements-PCR)对筛选出的动物源、水源耐万古霉素肠球菌进行分子分型及同源性分析。 结果： (1)从2个宠物医院、3个规模化猪场及1个规模化鸡场共420个样本，筛选出30株耐万古霉素肠球菌；从闽江、生活小区池塘、学校鱼塘、污水沟、下水道共200个样本，筛选出17株耐万古霉素肠球菌；不同猪场不同猪群的分离率以哺乳小猪最高，其次为保育小猪，不同水源的分离率以下水道最高，其次为污水沟；药敏实验结果显示，动物源、水源耐万古霉素肠球菌均以土霉素的耐药率最高，分别为93.3％和90％，均以氨苄西林的敏感率最高，分别为80％和88.2％。 (2)PCR检测万古霉素耐药基因，30株动物源耐万古霉素肠球菌中2株为VanA阳性，12株VanB阳性，7株VanC1阳性，5株VanC2/3阳性，4株未扩增出Van基因；17株水源耐万古霉素肠球菌中3株VanB阳性，9株VanC1阳性，5株VanC2/3阳性，未扩增出VanA基因。 (3)REP-PCR结果显示，30株动物源耐万古霉素肠球菌共分为13个型，用A-M表示。A型分为A1-A6亚型，F型分为F1-F3亚型，J型分为J1-J3亚型，B、C、D、E、G、H、I、K、L、M没有亚型。亲缘性分析，27、28、29号菌株具有100％的同源性，21和22、1和7、4和9、17和18、11和14、6和8等菌株间各自具有100％的同源性。17株水源VIE被扩增出3-9条带，大小在200bp-2000bp之间，共分为5个型，用A-E表示。A型分为A1-A3亚型，B、C、D、E没有亚型。5种基因型以A1型为主。A1型有6株，A2型有1株，A3型有2株，B型有3株，D型3株，C、E型各一株。9、10、11、14、16与17号，5、12与13号，3、4与7号，1与15号，均各自有100％的同源性。 结论： (1)动物源、水源均能分离出耐万古霉素肠球菌，所分离的耐万古霉素肠球菌对土霉素的耐药率最高，对氨苄西林的敏感率最高，VanA基因介导高水平耐药，VanC1、VanC2/3介导低水平耐药，耐药表型与基因型一致。 (2)同源性分析显示，同一猪场分离的耐万古霉素肠球菌具有较高的同源性，污水沟、下水道分离的水源耐万古霉素肠球具有较高的同源性。在动物源内、水源内分离的耐万古霉素肠球菌均发生不同程度的克隆传播。 (3)调查动物源、水源肠球菌对万古霉素的耐药及传播，可以有效的指导兽医临床合理用药，为控制VRE向人类的传播提供依据。

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前 言

第一章动物源、水源耐万古霉素肠球菌的分离及耐药表型测定

1材料和方法

1.1 材料

1.2方法

2 结果

2.1动物源、水源耐万古霉素肠球菌分离及鉴定结果

2.2耐万古霉素肠球菌对6种抗生素的药敏试验结果

2.3动物源与水源耐万古霉素肠球菌对6种抗生素的耐药性比较

3 讨论

3.1肠球菌的分离及鉴定方法

3.2抗生素敏感性试验方法

3.3动物源、水源耐万古霉素肠球菌的分离结果

3.4动物源、水源耐万古霉素肠球菌对6种抗生素的敏感性结果

第二章动物源、水源肠球菌万古霉素耐药基因检测

1材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1猪源肠球菌耐药基因检测结果

2.2水源肠球菌耐药基因检测结果

2.3动物源、水源万古霉素耐药基因检测结果比较

3 讨论

3.1耐药基因检测方法

3.2耐药基因检测结果

3.3耐药基因的来源

第三章 动物源、水源万古霉素耐药肠球菌同源性研究

1材料和方法

1.1 材料

1.2方法

2 结果

2.1 30株动物源耐万古霉素肠球菌的同源性比较

2.2 17株水源耐万古霉素肠球菌同源性比较

3讨论

3.1细菌分子分型方法

3.2动物源、水源耐万古霉素肠球菌同源性分析

全文结论

参考文献

致谢