氮素对羽叶决明单宁含量的影响及DFR基因的克隆

摘要

羽叶决明(Chamaecristanictitans)是一种豆科决明属、热带多年生牧草,具有明显的耐瘠、耐酸、抗旱性强等特点,目前在福建、江西、湖南等地得到广泛种植,广泛用于红壤改良、水土保持和畜牧养殖。羽叶决明在初花期的养分含量最高,其粗蛋白含量达15.9％。但由于含有较高的缩合单宁含量,影响了羽叶决明的畜牧利用。
　　 本研究设计0、15、30、45、60、75、90mg/kg·N7个氮素梯度处理(分别用CK、处理A、B、C、D、E、F表示),测定羽叶决明初花期时茎、叶组织中的缩合单宁含量,探索氮素对羽叶决明缩合单宁含量的影响;同时测定控制缩合单宁合成的关键酶二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)的活性;并对DFR基因进行了克隆,检测不同处理、不同组织中DFR基因的表达情况,以深入了解牧草中缩合单宁的合成机制,为人为调控提供分子生物学基础。主要结果如下:
　　 1、采用香草醛盐酸法,测定7个氮素梯度处理的羽叶决明的茎、叶中缩合单宁(CT)含量,结果表明羽叶决明叶片的CT含量明显高于茎,而且CT含量随着氮素施用量的增加而总体呈现下降趋势,说明氮素对缩合单宁的生成有一定的抑制作用。在7个氮素梯度处理中,羽叶决明叶中的CT含量由14.78％逐步下降到1.14％;而羽叶决明茎中的CT含量的变化表现为,在低氮梯度处理中有所上升,在处理B达到峰值(4.62％),然后迅速下降并终维持在稳定水平(0.98％～1.14％)。
　　 2、采用凯氏定氮法,测定7个氮素梯度处理的羽叶决明的茎、叶中粗蛋白(CP)含量,结果表明羽叶决明叶片的CP含量明显高于茎,但是随着氮素施用量的增加CP含量并没有大幅度的增加,只是略微有所上升,说明氮素对植株粗蛋白的含量没有明显的影响。在不同氮素梯度处理中,羽叶决明叶中的CP含量由18.52％增加到22.30％;而羽叶决明茎中的CP含量的增幅更小,7个氮素梯度处理中CP含量在5.73％～7.98％之间。
　　 3、采用连续监测法,测定不同氮素梯度处理后羽叶决明茎叶植株鲜样中二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)的活性表明,DFR酶活性与缩合单宁含量呈显著的正相关性(r茎=0.991,r叶=0.945)。叶中DFR活性从CK处理的310.1U/g下降到处理F的31U/g:茎中DFR酶活性同样在低氮梯度处理中略有上升,之后从处理B的103.69U/g迅速下降并维持在稳定水平(约50U/g)。
　　 4、采用RT-PCR方法,克隆得到羽叶决明DFR基因的cDNA片段,长度为600bp,包含一个编码200个氨基酸残基的阅读框,命名为CnDFR。序列比对发现,CnDFR编码的氨基酸与其它植物DFR蛋白基因有很高的同源性。蛋白质基本理化性质的分析,推测CnDFR编码蛋白,其理论相对分子质量为22421.6Kda,预测pI值为5.23,理论分子式为C1014H1568N254O301S9,不稳定系数为39.74,推测CnDFR编码蛋白是一个相对稳定的蛋白。
　　 5、采用实时荧光定量PCR,检测不同氮素处理后DFR基因在茎叶中的表达差异。总体上DFR基因在茎叶中表达的变化趋势是先上升后下降,之后又回升。在较低施氮水平下的表达差异变化与缩合单宁含量、DFR酶活性的变化是一致的。