柔嫩艾美耳球虫两个抗药株消减cDNA文库的序列分析

摘要

鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种对家禽业有严重危害的全球性寄生虫病。该病分布广泛,一年四季均有发病。目前,国内外防治鸡球虫病主要以向饲料中添加抗球虫药物预防为主,应用治疗性球虫药与鸡球虫活卵囊疫苗为辅。目前,球虫抗药性在全世界各地均有分布,而且球虫抗药性主要表现为多重抗药性和交义抗药性。鸡球虫对抗球虫药物产生的抗药性,大幅降低了养禽业的经济效益。迄今为止,球虫抗药性的产生机理仍然停留在理论研究阶段,尚未出现有关抗药性基因的报道。一般认为,球虫抗药性的产生是在抗球虫药物的选择压力下,突变虫体经过多次重复选择,使微弱的抗药性不断积累的结果。由于各种抗球虫约作用机制不同,抗药性产生的机制可能也会有差异。
　　 随着克隆和表达寄生虫特异性抗原基因技术的发展,人们通过构建cDNA文库从分子水平上研究与寄生虫抗药性产生有关的基因,来进一步了解寄生虫抗药性的产生机制。而抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)是目前快速克隆差异表达基因cDNA的有效方法之一。运用SSH技术可以找出与寄生虫生长发育、抗药性有关的差异表达基因,研究其抗药性产生机制。EST则是这些表达基因的部分cDNA片段。与整个基因组序列相比,EST序列具有快速、廉价和容易获得的优势。
　　 本研究在实验室前期工作中利用抑制性消减杂交技术构建了富含遗传背景一致的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株孢子化卵囊与敏感株孢子化卵囊之间差异表达基因的消减cDNA文库的基础上,对柔嫩艾美耳球虫两个抗药株消减cDNA文库进行了序列测定和生物信息学初步分析。
　　 从地克珠利抗药株消减cDNA文库中成功得剑568条EST。经拼接和聚类后得到107个独立基因(Unigenes),包含44个单拷贝基因(singlets)和63个重叠群(eontigs),EST出现8次以上的高半度表达基因占12.1％;EST的平均长度605 bp,97.2％的EST＞300 bp,其中500～900 bp的EST占58.9％:有13个Unigenes具有poly(A)结构、5个具有poly(T)结构。与数据库进行同源性比对,结果高度同源的基因占82.2％(0≤E≤e-100),未知基因占10.3％(E＞e-20),另有3个基因没有同源性匹配;通过搜索UniProt数据库得到72个Unigenes的功能注释,来源于11个物种,其中源自E.tenella的只占11.2％,而源自刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的占39.3％。另外,具有GO功能分类的Unigenes有66个,分属于生物过程(17个),细胞组分(7个)和分子功能(42个)。经ESTScan分析,没有终止密码子的最大读码框和长度＞300 bp的ORF有89个。搜索COGs数据库后,有23个Unigenes归入适当的COG家族。
　　 从马杜拉霉素抗药株消减cDNA文库中成功得剑475条EST。经拼接和聚类后得到87个独立基因(Unigenes),包含45个单拷贝基因(singlets)和42个重叠群(contigs),EST出现8次以上的高丰度表达基因占19.5％:EST的平均K度615 bp,90.8％的EST＞300 bp,其中500～900 bp的EST占51.7％;有11个Unigenes具有poly(A)结构、2个具有poly(T)结构。与数据库进行同源性比对,结果高度同源的基因占70.1％(0≤E≤e-100),未知基因占19.6％(E＞e-20),另有7个基因没有同源性匹配;通过搜索UniProt数据库得到63个Unigenes的功能注释,来源于11个物种,其中源自E.tenella的只占17.5％,而源自T.gondii的占60.3％。另外,具有GO功能分类的Unigenes有58个,分属于生物过程(11个)、细胞组分(6个)和分子功能(41个)。经ESTScan分析,没有终止密码子的最大读码框和长度＞300bp的ORF有68个。搜索COGs数据库后,有19个Unigenes归入适当的COG家族。
　　 综上,水研究首次对利用遗传背景完全相同的柔嫩艾美耳球虫抗药株和敏感株构建的2个消减文库进行了全部序列分析,发现了一批新基因,对这些基因的注释和生物信息学分析,可望为研究球虫抗药性产生机理、建立E.tenella对上述2种药物抗药性的分子检测技术、预防和延缓抗药性的产生提供的研究思路。也丰富和发展了球虫基因组学研究,为预防和控制球虫病提供基础。